婦科病證結(jié)合動物模型的研究

俞丕超，張建偉

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合生殖與遺傳中心，山東 濟(jì)南 250011)

在婦科領(lǐng)域中，各種疾病發(fā)病機(jī)制及各種新的治療方法的研究在很大程度上依賴于動物實(shí)驗(yàn)研究。隨著婦科疾病的發(fā)生、發(fā)展，病證結(jié)合動物模型成為重要的實(shí)驗(yàn)方法和手段。目前婦科病證結(jié)合動物模型的研究主要涉及月經(jīng)病、婦科雜病等，將病和證緊密的結(jié)合，更好地模擬臨床狀態(tài)。

1 婦科病證結(jié)合模型的造模方法

1.1 復(fù)合因素建立婦科病證結(jié)合模型 該方法是指在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論與實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)知識，分別(或同時)采用傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)病因復(fù)制證候動物模型和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病因復(fù)制疾病模型，使模型動物同時具有疾病和證候特征。

1.1.1 肝郁血瘀型宮環(huán)出血病證結(jié)合大鼠模型 李慧[1]選用體質(zhì)量(280±300)g SD雌性大白鼠，已育未孕，采用秦大蓮等[2]的造模方法略加改進(jìn)，通過手術(shù)將改造后的IUD固定于右側(cè)子宮壁上，手術(shù)7 d后，參照高蕭楓等[3]的方法結(jié)合孤養(yǎng)造成肝郁模型，將大鼠單籠孤養(yǎng)，用細(xì)紗條束縛四肢，使其正常生存本能受阻而不能表達(dá)，導(dǎo)致肝疏泄不及，形成一種“郁怒”狀態(tài)，持續(xù)時間從第1天的4 h逐漸增至每天6 h，連續(xù)28 d。自造模第22天開始予宮環(huán)止血Ⅰ號(香附10 g，白芍10 g，三七3 g，炒蒲黃10 g，馬鞭草12 g，仙鶴草10 g，女貞子10 g，旱蓮草10 g。經(jīng)80 ℃水浴蒸發(fā)濃縮成含生藥1.5 g/mL的濃縮藥液，置4 ℃冷藏備用)按0.665 g/100(g·d)灌胃，共計(jì)7 d。以大鼠的體質(zhì)量、蔗糖水?dāng)z入量以及行為學(xué)指標(biāo)的變化作為觀察指標(biāo)，并應(yīng)用抗體芯片技術(shù)測量動物模型子宮組織細(xì)胞因子水平。造模成功后大鼠表現(xiàn)出飲食、活動減少，喜歡貼壁、叫聲尖細(xì)、胡須下垂、反應(yīng)遲緩等情志和行為的改變，符合肝郁證動物模型的癥狀[4-5]。體質(zhì)量增長緩慢，蔗糖攝入率降低，提示肝郁大鼠模型快感缺乏，對獎賞刺激興趣缺失，藥物治療后以上癥狀均得到緩解。子宮組織細(xì)胞因子中睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)顯著降低，白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)顯著升高，而治療藥物可逆轉(zhuǎn)這種表達(dá)，甚至使其接近正常水平。

1.1.2 氣虛血瘀證卵巢癌大鼠模型 張勤華等[6]選用清潔級Wistar雌性大鼠，體質(zhì)量100～120 g，4～6周齡。手術(shù)將致癌劑二甲基苯蒽(DMBA)藥線埋入大鼠卵巢內(nèi)，術(shù)后將大鼠放回籠中飼養(yǎng)[7]。正常飲食+大黃芒硝合劑(大黃煎煮去渣，與芒硝按照4：1的比例濃縮成含生藥1.5 g/mL的藥液備用，藥量按成人每kg體質(zhì)量的20倍計(jì)量)灌胃2 mL/隔日×4周，共8周。觀察大鼠的毛發(fā)、飲食、排泄、活動等情況。每周測量大鼠體質(zhì)量，繪制體質(zhì)量增長曲線。造模成功后大鼠體質(zhì)量增長緩慢、腫瘤出現(xiàn)提前、腹水發(fā)生增加。35周全部處死剖腹探查。比較平均成瘤時間，腫瘤發(fā)生率、轉(zhuǎn)移及腹水發(fā)生率，35周之前死亡的當(dāng)即剖腹探查。在灌胃2、4、8周分別取大鼠尾靜脈血，制成涂片，用圖像分析儀測出30個T淋巴細(xì)胞核仁銀染強(qiáng)度的平均值，用核仁銀染面積(S核仁)與細(xì)胞核面積(S核)的比值來表示。同時取0.5 mL血，按照郭峰[8]紅細(xì)胞免疫黏附酵母菌花環(huán)法，以紅細(xì)胞結(jié)上1個或以上酵母菌算1個花環(huán)，計(jì)數(shù)100個紅細(xì)胞的花環(huán)率。崔英等[9]證實(shí)，卵巢癌患者出現(xiàn)繼發(fā)性紅細(xì)胞免疫功能降低。造模后大鼠紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率顯著降低，從而驗(yàn)證了模型的成功。

1.1.3 更年期綜合征陰虛內(nèi)熱證大鼠模型 胡隨瑜等[10]選用(162.4±2.3)gWistar雌性大鼠，手術(shù)摘除大鼠的卵巢，術(shù)后第4、5、6、7天逐只進(jìn)行陰道涂片檢查，以確定卵巢摘除完全。術(shù)后第8天，開始灌服熱性中藥(制附片25 g和干姜25 g等量水煎煮成含生藥濃度為50%，按劑量20 mL/kg灌胃)，連續(xù)灌服14 d。停止造模后第10天，模型大鼠血清E2的水平下降，LH、FSH的水平上升，子宮重量減輕，并且出現(xiàn)血漿NE、E、腦組織5-HT值升高、體質(zhì)量增長緩慢、舌尖色紅、飲水量增加、肛溫上升等陰虛內(nèi)熱證[11]。在末次灌服熱性中藥24 h后，開始治療性給藥，灌服地貞顆粒9 d后,大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌的紊亂和陰虛內(nèi)熱的癥狀明顯改善，則造模成功。

1.1.4 腎虛血瘀型子宮內(nèi)膜異位癥模型 冉青珍等[12]選用體質(zhì)量200 g雌性SD大鼠，3月齡。每日進(jìn)行陰道細(xì)胞涂片檢查，選擇動情周期[13]4～5 d者為合格動物。在腎虛血瘀證模型的基礎(chǔ)上按西醫(yī)“自體移植法”造子宮內(nèi)膜異位癥疾病模型[14]。造模成功后大鼠被毛蓬松、硬、凌亂，拱背少動、扎堆怕冷、大便稀溏等。舌質(zhì)絳紫黯淡；尾部自尖至根出現(xiàn)不同程度皮下瘀紫或青斑、眼球轉(zhuǎn)為黯紅；后肢行動艱難遲緩等腎虛與血瘀的臨床表現(xiàn)。血液流變學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)明顯升高，即血液呈“黏滯”狀態(tài)，符合中醫(yī)“血瘀”微觀狀態(tài)。

1.2 單一因素建立婦科病證結(jié)合模型 該方法是指使用單一因素作為病證結(jié)合模型疾病與證候共同的造模因素。

1.2.1 經(jīng)前期綜合征肝氣郁證大鼠模型 宋洪運(yùn)[15]選用健康SD雌性大鼠,體質(zhì)量180～220 g。按陰道涂片鏡檢法觀察大鼠各期細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量，確定動情周期，選取處于動情后期的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。參照文獻(xiàn)[16]方法束縛造模，將擬造模大鼠前足與對側(cè)后足用無菌紗布捆縛，妨礙其自由活動，同時造?；\中放入自由活動大鼠以增強(qiáng)致郁效應(yīng)。造模同時每日給經(jīng)前舒顆粒(10 g/kg，相當(dāng)于人臨床8倍劑量)，造模完成后即進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)測定相關(guān)行為學(xué)指標(biāo)[17]，隨后處死。斷頭取血，以放射免疫法測定血清E2、FSH、LH含量。造模后曠場實(shí)驗(yàn)得分顯著減少，提示大鼠活動量明顯減少，興奮性降低，大鼠行為表情結(jié)果則不活躍，精神萎靡，眼神呆滯，相互扎堆睡覺，對外界刺激不敏感。E2水平下降，F(xiàn)SH水平顯著上升，LH無明顯變化，F(xiàn)/L比增大，提示大鼠存在卵巢功能衰退的生理變化。而給予經(jīng)前舒顆粒干預(yù)后，肝郁癥狀緩解，相關(guān)指標(biāo)得到恢復(fù)或改善。

1.2.2 腎陽虛排卵障礙大鼠模型 時思光[18]選用體質(zhì)量(220±10)g SD雌性大白鼠，未孕未產(chǎn)，10～12周齡，每日下肢肌注氫化可的松注射液36 mg/kg，連續(xù)11 d。給藥第5天起，造模大鼠逐漸出現(xiàn)一系列“腎陽虛”的表現(xiàn),給藥11 d后將造模大鼠開腹，腹主靜脈取血，測定血清E2、FSH、LH水平均明顯降低，取子宮、卵巢，顯微光鏡下組織形態(tài)學(xué)及超顯微結(jié)構(gòu)檢查，病理改變提示為排卵抑制，造模后大鼠陰道涂片周期性變化消失，符合腎虛排卵障礙的證候與病理特征，則造模成功。

1.2.3 腎虛黃體抑制流產(chǎn)病證結(jié)合動物模型 寧艷等[19]選用健康、未產(chǎn)、10～12周齡、體質(zhì)量約200～250 g的SD大鼠，參照周莉等[20-21]的報(bào)道，采用羥基脲和米非司酮造模。按雌、雄為2∶1合籠，置于18～24 ℃動物房中喂養(yǎng)。每日晨陰道涂片，以發(fā)現(xiàn)大量精子日作為妊娠第1天。從妊娠第1天到第10天灌服羥基脲(450 mg/kg)造成黃體抑制模型，第11天灌服米非司酮(3.75 mg/kg)，第12天將大鼠麻醉后解剖，剪取子宮稱重，記錄胚胎數(shù)和流產(chǎn)數(shù)，0、10、11、12 d 均取血液樣本，-20℃保存血清，測定自由基過氧化物歧化酶(SOD)，觀察妊娠大鼠子宮內(nèi)胚胎發(fā)育和流產(chǎn)情況。妊娠大鼠均于造模后幾天出現(xiàn)納食減少、活動減少、反應(yīng)遲鈍、毛色干枯等癥狀，體質(zhì)量明顯下降，SOD明顯降低[22]。研究[23]提示自由基含量可作為腎虛證的辨證指標(biāo)之一。造模后胚胎著床數(shù)減少。

2 問題與展望

綜合近年來婦科病證結(jié)合動物模型的研究，存在以下問題：1)目前主要局限于月經(jīng)病的研究，辨證分型尚缺少系統(tǒng)研究，局限于肝郁、腎虛。2)模型制備上，多為疾病動物模型與中醫(yī)證候動物模型嫁接，需創(chuàng)建符合婦科疾病特點(diǎn)的病證結(jié)合動物模型并使之規(guī)范化。3)以證候?yàn)閮?nèi)容的模型評價(jià)體系尚不健全，血瘀、氣滯、濕熱、脾虛、陰虛等這些辨證類型的標(biāo)準(zhǔn)尚無統(tǒng)一定論。今后的研究方向：1)中醫(yī)婦科學(xué)在臨床應(yīng)用中的突出特色與優(yōu)勢在于調(diào)經(jīng)、助孕、安胎、治療帶下病、產(chǎn)后病及雜病等。因此除月經(jīng)病應(yīng)開展更多其他婦科疾病的病證結(jié)合研究，如妊娠病、產(chǎn)時病、產(chǎn)后病、婦科雜病、前陰病等。從而為臨床工作奠定基礎(chǔ)。2)婦女“以血為本，以氣為用”。月經(jīng)、胎孕、產(chǎn)育、哺乳都是以血為用，血為氣之配，血病則氣不能獨(dú)化，氣病則血行不暢。故模型制備方法上，應(yīng)結(jié)合婦科的生理病理特點(diǎn)，在西醫(yī)疾病模型的基礎(chǔ)上，不施加人為干預(yù)因素，在疾病模型建立過程中或建成后，觀察并檢測疾病模型所表現(xiàn)的中醫(yī)證型(如陰陽、虛實(shí)、寒熱等)，從而更好地體現(xiàn)婦科疾病中醫(yī)“證”的階段性、動態(tài)性。3)對證候的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)除模型動物的宏觀體征、行為表現(xiàn)及與證候相關(guān)的個別理化指標(biāo)，應(yīng)增加以方測證的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選用治療婦科疾病的古方、效方對所建立的模型進(jìn)行證實(shí)，以方證相應(yīng)、方證相佐理論驗(yàn)證所建立模型的可靠性。隨著中醫(yī)學(xué)研究的不斷深入及多學(xué)科的參與，相信婦科病證結(jié)合動物模型將會得到進(jìn)一步提高和發(fā)展，從而更好地指導(dǎo)臨床。

[1]李慧.肝郁血瘀型宮環(huán)出血病病證結(jié)合大鼠模型的建立及研究[D].長沙:湖南中醫(yī)藥大學(xué),2010:1-6.

[2]秦大蓮,陳美娟,李曉冰,等.固環(huán)止血膠囊對置IUD大鼠血漿及子宮組織ET和TXBZ的影響[J].中藥藥理與臨床,2006,22(3):149-150.

[3]高蕭楓,秦雪梅,王明軍.逍遙散和柴胡對慢性束縛應(yīng)激肝郁模型大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J].中藥藥理與臨床,2005,21(2):6-7.

[4]徐舒,陳合兵,李洪,等.“肝郁證”大鼠模型的建立及代謝組學(xué)的初步研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2009,24(6):787-791.

[5]丁杰,陳家旭,李植延.肝氣郁結(jié)大鼠胃彩膜結(jié)構(gòu)和功能變化的實(shí)驗(yàn)研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2007,34(2):229-232.

[6]張勤華,黃宗瀚,齊聰.原發(fā)性卵巢癌大鼠氣虛血瘀證模型的建立與研究[J].中國中醫(yī)藥雜志,2005,3(3):607-608.

[7]張勤華.增免抑瘤合劑合并化療對卵巢癌大鼠細(xì)胞免疫功能的影響[J].中國中醫(yī)藥雜志,2004,(5):501-502.

[8]郭峰.紅細(xì)胞免疫及其調(diào)節(jié)功能的測定[J].免疫學(xué)雜志,1990,6(1):60.

[9]崔英,郭峰,張其,等.卵巢腫瘤患者紅細(xì)胞免疫功能及超氧化酶的初步研究[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),1995,16(6):558-560.

[10]胡隨瑜,尤勁松,向群輝,等.地貞顆粒對“更年期”擬陰虛內(nèi)熱證模型大鼠的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2000,11(3):143-145.

[11]劉家駿,劉健鴻,劉小勤,等.真氣意念調(diào)息對人體的生化—內(nèi)分泌指標(biāo)的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2002,20(5):622-623.

[12]冉青珍,陳萬群.腎虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥不孕癥動物模型的建立與評價(jià)[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,10(1):130-132.

[13]施新猷.醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1983:141-143.

[14]冉青珍,符路娣,陳萬群,等.子宮內(nèi)膜異位癥大鼠血漿神經(jīng)內(nèi)啡肽特點(diǎn)及其對妊娠功能的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2006,23(3):222.

[15]宋洪運(yùn).經(jīng)前期綜合征肝氣郁證大鼠模型血清遞質(zhì)、激素和代謝組學(xué)研究[D].濟(jì)南:山東中醫(yī)藥大學(xué),2010:3-8.

[16]喬明琦,張惠云,陳雨振,等.肝郁證動物模型研究的理論思考[J].中國醫(yī)藥學(xué)報(bào),1997,12(5):42.

[17]劉曉偉,張紅梅,曲宏達(dá),等.“怒傷氣”大鼠行為觀察與檢測[J].江蘇中醫(yī)藥,2005,26(3):53.

[18]時思光.補(bǔ)腎寧對腎陽虛排卵障礙大鼠神經(jīng)遞質(zhì)及生殖機(jī)能調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究[D].哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),2010:44-49.

[19]寧艷,羅頌平,梁國珍.補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方對腎虛黃體抑制妊娠大鼠流產(chǎn)模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào),2000,15(6):28-30.

[20]周莉,吳純啟,姜忠彩,等.羥基脲對大鼠生育能力的影響[J].毒理學(xué)雜志,2006,20(3):167-168.

[21]崔美蘭,黃雅文,黃桂華.藥物流產(chǎn)中米非司酮最適劑量探討[J].國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào),2007,13(14):81-83.

[22]陳晏珍.腎虛與超氧化物歧化酶關(guān)系初探[J].中醫(yī)雜志,1989(4):34.

[23]韓勃.自由基與中醫(yī)證型研究概況[J].甘肅中醫(yī),1994,7(5):46.