保健食品榮骨膠囊中蛋白質(zhì)含量測(cè)定

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(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.吉林省食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 長(zhǎng)春 130033；3.長(zhǎng)春市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 長(zhǎng)春 130021；4.白城市中醫(yī)院，吉林 白城 137000)

榮骨膠囊是以鹿茸為原料加工而成的膠囊制劑。鹿茸為雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，具有壯腎陽(yáng)，益精血，強(qiáng)筋骨，調(diào)沖任，托瘡毒等作用。研究表明[1-3]，鹿茸中含有大量的膠原蛋白、多胺、酸性黏多糖等類成分，其膠原蛋白具有治療骨質(zhì)疏松的作用[4-7]。榮骨膠囊制劑主要成分為膠原蛋白，膠原蛋白是以黏多糖作為側(cè)鏈的蛋白質(zhì)之總稱，其側(cè)鏈的黏多糖和核心蛋白在治療骨質(zhì)疏松方面各自的作用目前尚不清楚，因此，對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究時(shí)，我們選用蛋白質(zhì)含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)之一。

1 實(shí)驗(yàn)材料

752紫外光柵分光光度計(jì)；對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(批號(hào)9048- 46-8)購(gòu)自Sigma公司，對(duì)照品純度均為99%。所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

蛋白質(zhì)含量測(cè)定中所需的試劑甲、試劑乙為本實(shí)驗(yàn)室配制。試劑甲(A)：10 g碳酸鈉、2 g氫氧化鈉和0.25 g酒石酸鉀鈉加蒸餾水配成500 mL溶液，試劑甲(B)：0.5 g硫酸銅溶解于100 mL蒸餾水中，每次用時(shí)將50分(A)與1分(B)混合為試劑甲。試劑乙：在1.5 L容積的磨口回流瓶中加入100 g鎢酸鈉、25 g鉬酸鈉及700 mL蒸餾水，再加50 mL 85%磷酸，100 mL濃HCl充分混合，接上回流冷凝管以小火回流10 h。回流結(jié)束后，加入150 g硫酸鋰，50 mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15 min以驅(qū)除過(guò)量的溴，冷卻后溶液呈黃色。稀釋至1 L，過(guò)濾，濾液于棕色瓶中保存，用前稀釋1倍即為試劑乙。

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重牛血清白蛋白對(duì)照品，置量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL含牛血清白蛋白308 μg)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.4、0.8、1.6、2.0 mL加入5個(gè)試管中，標(biāo)準(zhǔn)溶液補(bǔ)水至2 mL，加入5 mL試劑甲，搖勻，靜止10 min，然后加入0.5 mL試劑乙，立即振蕩搖勻，靜止30 min后，以標(biāo)準(zhǔn)溶液第1管為對(duì)照，照分光光度法(《中國(guó)藥典》2005版附錄VA)，在660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以牛血清白蛋白μg數(shù)對(duì)應(yīng)的吸收度，計(jì)算回歸方程。

2.3 測(cè)定方法 精密稱取供試品配置成溶液濃度為626 μg/mL，作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液0.8、1.6 mL加水至2 mL,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下自“加入5 mL試劑甲”起，依法操作，測(cè)定吸收度，由回歸方程計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 按照含量測(cè)定的方法制訂標(biāo)準(zhǔn)曲線，牛血清白蛋白濃度308 μg/mL，見(jiàn)表1。

表1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品按正文含量測(cè)定方法，顯色后每隔10 min測(cè)其吸收度,吸收度在顯色后30 min內(nèi)穩(wěn)定，30 min以后吸收度降低，故正文規(guī)定應(yīng)在顯色后30 min內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 蛋白穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取樣品定容后，連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算其RSD值，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 蛋白精密度考察結(jié)果

結(jié)果表明，RSD=0.61%，所用儀器精密度良好。

2.4.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取樣品5分，按含量測(cè)定項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 蛋白重現(xiàn)性考察結(jié)果

結(jié)果表明，RSD=0.33%,該方法重現(xiàn)性很好。

2.4.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知蛋白含量為29.13%的樣品，配成0.5 mg/mL，精密吸取5分，每分0.1 mL，分別加入對(duì)照品溶液(濃度：50 μg/mL)、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mL。按含量測(cè)定項(xiàng)下方法操作，以測(cè)得的含量減去樣品中蛋白含量，除以已知對(duì)照品加入量，得回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 蛋白回收率試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，本法平均回收率為98.80%，RSD=1.84%，表明本法回收率良好，準(zhǔn)確度較高。

3 結(jié)論

3.1 結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此含量測(cè)定方法準(zhǔn)確，可靠，并依照此方法對(duì)4批樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果4批樣品蛋白含量分別為29.14%、29.15%、29.13%、29.17%。

3.2 結(jié)論 鹿茸中的膠原蛋白類成分是鹿茸中比較大量和特殊的成分，多做為組織和細(xì)胞的重要組成成分和細(xì)胞間信息傳遞的成分，顯示了多方面的藥理作用。我們?cè)鴮?duì)這些成分進(jìn)行過(guò)研究，發(fā)現(xiàn)其在治療老年癡呆(動(dòng)物模型)、貧血和骨質(zhì)疏松等方面都具有一定的活性。與鹿茸的強(qiáng)筋健骨、補(bǔ)益氣血的傳統(tǒng)作用相一致。榮骨膠囊是以鹿茸為主要功效的保健品，因此，控制其中蛋白質(zhì)的含量是必要的。本文報(bào)道的含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定，適合作為榮骨膠囊生產(chǎn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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