白耙齒菌發(fā)酵物多糖及蛋白的含量測定

袁文彬，王淑敏，陳 新，翁麗麗*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2.吉林省消防總隊醫(yī)院，吉林 長春 130061)

白耙齒菌(IrpexlacteusFr.)為齒菌科耙齒菌屬的一種藥用真菌，別名白囊孔。其子實體生于闊葉樹的枯立木、枯枝上。主要分布于吉林省長白山區(qū)、河北、山西、陜西、河南、甘肅、安徽和浙江等省區(qū)[1]。其發(fā)酵物用于治療腎小球腎炎。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 SPD-10Avp紫外分光光度計。

1.2 試劑 白耙齒菌發(fā)酵物由長春中醫(yī)藥大學(xué)真菌研究室提供。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品由中國藥品生物制品檢定所提供；牛血清蛋白購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。3,5-二硝基水楊酸試劑、考馬斯亮藍G-250等。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖的含量測定[2-3]

2.1.1 對照品溶液的制備 取于105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品約10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取本品粉末約1 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水50 mL使溶解，水浴保溫30 min，定容至刻度。過濾，供配制總糖供試液和還原糖供試液。

總糖供試液的制備：精密量取供試品溶液制備項下續(xù)濾液2 mL，置25 mL容量瓶中，加6 N鹽酸8 mL，置沸水浴加熱30 min，冷卻后加1滴酚酞指示劑，用40%氫氧化鈉溶液中和至微紅色,加水定容至刻度，搖勻即得。

還原糖供試液制備：精密量取供試品溶液制備項下續(xù)濾液2 mL，置10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻即得。

2.1.3 測定法 精密量取總糖及還原糖供試品溶液各1 mL，分別置25 mL容量瓶中，分別加入1 mL水及1.5 mL 3、5-二硝基水楊酸試劑，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定吸收度，計算總糖及還原糖的量，以總糖的量減去還原糖的量即為多糖的量。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 線性關(guān)系考察 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分別置于25 mL容量瓶中，補水至2.0 mL，分別加入3、5-二硝基水楊酸試液1.5 mL，混勻，沸水浴5 min，取出，立即冷卻至室溫，加水定容至刻度，搖勻，依照分光光度法，在532 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸收度為縱坐標(biāo)，以取樣量為橫坐標(biāo)(mg)，得回歸方程：Y=0.559 4X-0.043 4r=0.999 6，線性范圍在0.200 4～1.402 8 mg。

2.1.4.2 精密度實驗 取總糖供試液，照測定法重復(fù)測定吸光度6次，結(jié)果分別為0.471、0.471、0.471、0.471、0.471、0.472，=0.471，RSD=0.087%。結(jié)果表明儀器具有良好的精密度。

2.1.4.4 重現(xiàn)性實驗 按以上方法制備供試品溶液，重復(fù)6次，依法測定多糖含量，結(jié)果分別為8.07、8.04、8.10、8.06、8.11、8.09，=8.08，RSD=0.330%。表明該方法測定多糖含量重現(xiàn)性好。

2.1.4.5 回收率實驗 采用加標(biāo)回收率實驗，依法測定總糖供試液吸收度，計算回收率，結(jié)果本方法葡萄糖的平均回收率為102.2%，RSD=1.920%，說明該方法測定多糖含量穩(wěn)定可靠。

2.1.4.6 樣品含量測定 樣品依法平行測定2次，結(jié)果分別為8.54%，8.32%，平均值8.43%。

2.2 蛋白的含量測定[4]

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的配制 取20 mg牛血清蛋白，精密稱定，置10 mL的容量瓶中，用0.9%的NaCl溶液定容至刻度。

2.2.2 樣品溶液的制備 取樣品約0.8 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用0.9% NaCl溶液定容至刻度。

2.2.3 測定法 移取樣品溶液100 μL于試管中，加入5 mL考馬斯亮藍溶液，混合均勻后測定其吸光度值，計算含量。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 取8支10 mL干凈的試管，精密加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0.01、0.03、0.04、0.06、0.07、0.08 mL，分別補充0.9% NaCl溶液至0.1 mL，加入考馬斯亮藍試劑5 mL，混合后在5 min內(nèi)測定其在595 nm波長下的吸光度值，記錄各管測定的吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，以取樣量為橫坐標(biāo)(mg)，得回歸方程：Y=0.003 9X+0.040 8，r=0.999 5，線性范圍在20.03～160.21 μg。

2.2.4.2 精密度實驗 取供試液，照測定法重復(fù)測定吸光度6次，結(jié)果分別為0.434、0.434、0.434、0.433、0.433、0.433，=0.433 5，RSD(%)=0.126%。結(jié)果表明儀器具有良好的精密度。

2.2.4.4 重現(xiàn)性實驗 按以上方法制備供試品溶液，重復(fù)6次，依法測定蛋白含量，結(jié)果分別為1.049、1.023、1.039、1.033、1.025、1.075，=1.041，RSD(%)=1.886%。表明該方法測定蛋白含量重現(xiàn)性好。

2.2.4.5 回收率實驗 采用加標(biāo)回收率實驗，依法測定，計算回收率，結(jié)果平均回收率為98.0%，RSD=1.379%，說明該方法測定蛋白含量穩(wěn)定可靠。

2.2.4.6 樣品含量測定 樣品依法平行測定2次，結(jié)果分別為1.21%，1.25%，平均值1.23%。

3 小結(jié)

3.1 白耙齒菌發(fā)酵物含有多糖類，其水解產(chǎn)物還原糖與3,5二硝基水楊酸試劑供熱后生成紅棕色的氨基化合物，在一定濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與反應(yīng)物的顏色成比例關(guān)系，故利用比色法可以測定樣品中糖的含量，方法簡單，可操作性強。

3.2 考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)是屬于染料結(jié)合法的一種。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G-250結(jié)合物在595 nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)的含量成正比，故適用于蛋白質(zhì)含量測定。

[1]李茹光.吉林省真菌志[M].長春:東北師范大學(xué)出版社,1991:133.

[2]鄭波,翁硯,翁麗麗.蛹蟲草與冬蟲夏草的含量測定研究[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2011,27(2):290-291.

[3]尹銀嘉,魏士超,馬寶瑕.3,5-二硝基水楊酸法測二味康口服液中多糖的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2003,23(7):414-415.

[4]趙英永,戴云,崔秀明,等.考馬斯亮藍G-250染色法測定草烏中可溶性蛋白質(zhì)含量[J].云南民族大學(xué)學(xué)報,2006,15(3):235-237.