現代生物技術在我國蘿卜遺傳育種中的應用與展望

熊秋芳，張小康，汪志紅，周國林，李世升

（武漢市蔬菜科學研究所，430345）

蘿卜（Raphanus sativusL.）為十字花科蘿卜屬一年或二年生雄雌同花的異花授粉作物，在我國栽培歷史悠久。蘿卜雜種優勢十分明顯，目前主要利用雄性不育系進行制種。現代蘿卜育種所要改良的目標性狀也在不斷的變化，除了對豐產、優質、抗病的要求越來越具體以外，又提出一些新的目標，如耐熱、耐抽薹、早熟、晚熟、品質優、口感佳。

常規育種方法在生產上應用廣泛，技術容易掌握，具有不可低估的潛力，但也往往具有局限性，如育種年限長。現代生物技術是細胞生物學與分子生物學理論指導下發展起來的一種高新技術，從20世紀70年代開始發展，給動植物品種改良帶來了一場革命。包括基因工程技術、小孢子培養技術、原生質體融合技術、誘變技術在內的現代生物技術大大加快了蔬菜遺傳改良的步伐，把育種技術從宏觀水平提高到微觀水平。現對現代生物技術在我國蘿卜遺傳育種中的應用加以綜述，并對蘿卜育種中還未涉及到的技術加以展望，以期為蘿卜遺傳育種及資源創新提供新的思路。

1 小孢子培養技術與蘿卜遺傳育種

1.1 小孢子培養技術

小孢子是指未成熟的單核花粉細胞。小孢子培養技術是將小孢子從花藥中分離出來，以單個小孢子作為外植體進行培養，促進其細胞分裂和單倍體胚，進而誘導發育成單倍體植株的過程。實踐證明，經小孢子培養得到的雙單倍體或DH系株系間的性狀變異幅度大，超親現象和出現特殊優良性狀的頻率顯著高于常規育種，株系內性狀整齊，世代間穩定性強。通過小孢子培養出來的自交系具有高度的純合性，以此配制的雜交組合往往具有更強的雜種優勢。另外小孢子培養所得的胚狀體可以作為理想的轉基因受體，用于植物基因工程外源基因導入。

1.2 蘿卜小孢子培養

蘿卜小孢子培養始于20世紀80年代，Liehter[1]首次報道了蘿卜游離小孢子培養成功誘導出胚狀體。Takahata等[2]對11份蘿卜材料進行了培養，其中有6份獲得了胚狀體，部分獲得了再生植株。張麗[3]以20個不同類型的蘿卜品種為材料，應用大量元素減半的1/2 NLN液體培養基進行小孢子培養，其中1份材料獲了胚狀體。付傳翠等[4]認為蘿卜中普遍存在基因型偏性問題，在預處理過程中保存較高活力是小孢子誘導成功的關鍵。陳文輝等[5]對30份夏秋蘿卜進行培養，有4份秋蘿卜材料獲得胚狀體，認為基因型與誘導率有很大的相關性，低溫預處理花蕾可以顯著提高出胚率，33℃高溫熱激處理48 h是改變小孢子發育途徑的重要條件。周志國等[6]以蘿卜游離小孢子再生植株為試驗材料，采用形態學觀察、根尖染色體鑒定、流式細胞測定等方法進行了倍性檢測。結果表明，由游離小孢子培養獲得的植株中同時含有單倍體、雙單倍體和多倍體，來源不同的小孢子培養獲得的植株倍性比例不同，不同倍性植株具有不同的形態特征。熊秋芳[7]在1/2 NLN-12培養基中，游離小孢子培養20～25 d后，20個基因型中有8個獲得了胚狀體，占供試材料的40%。對千禧二號蘿卜雙單倍體植株進行親和指數的測定，結果顯示雙單倍體植株蕾期親和指數均大于5，花期親和指數均小于0.3，符合自交不親和系的標準，可以作為親本配制雜交組合。

2 原生質體融合技術與蘿卜遺傳育種

2.1 原生質體融合技術

原生質體融合，亦稱細胞融合、體細胞雜交、超性雜交或超性融合，是指不同種類的原生質體不經過有性階段，在一定條件下融合創造雜種的過程。原生質體融合可避免受精作用中的種的特異性配子識別反應，有可能打破遠緣雜交中的有性不親和界限。原生質體技術還可用于種質資源的保存、細胞突變體的篩選、細胞器移植和外源DNA的導入等方面。自從1960年Cocking首次用纖維素酶制備番茄根原生質體獲得成功后，迄今已有46個科160多個屬360多種植物的原生質體再生植株問世，80多種科間、屬間、種間或品種間細胞融合獲得胞質種。近年來，人們將原生質體技術廣泛應用于蔬菜育種工作中，并取得了令人矚目的成果，獲得了甘藍和白菜、番茄、油菜、蘿卜等體細胞雜交植株[8]。

2.2 蘿卜原生質體融合

原生質體融合是將兩種異源原生質體，在誘導劑的誘發下相互接觸，從而發生膜融合、胞質融合和核融合，再經過細胞壁再生形成雜種細胞的過程。雷開榮等[9]以甘藍生產種為受體，以高抗黑腐病、軟腐病及根腫病的蘿卜野生材料為供體，在原生質體融合前，用酶或酶+紫外線對供體原生質體進行單因素或雙因素復合處理，以探討不同處理方法對植株再生的影響。結果表明，對供體親本進行雙因素復合處理，實現了原生質體非對稱性融合并獲得再生植株。孫振久[10]先后探討了不同電融合條件、融合液、原生質體密度及不同品種對甘藍和蘿卜原生質體融合及細胞分裂的影響，為蘿卜原生質體融合技術的應用奠定了很好的基礎，是成功獲得雜種再生植株的前提。

遠緣雜交可以有效地進行異種、屬間遺傳物質的相互引入和轉移，有目的地進行作物性狀改良，在作物育種上具有廣泛應用。蘿卜具有優良的抗線蟲病基因和細胞質雄性不育基因，若通過遠緣雜交的方法將蘿卜的優良基因導入其他作物中，無疑對當前作物育種具有重要的意義，同樣我們也可以將別的作物的優良基因導入蘿卜中來。人們已獲得了蘿卜蕓薹、蘿卜甘藍、蘿卜黑芥等新品種[11]，但成功率不高。胡大有等[12]2004年利用3個甘藍型油菜品種和1個黑芥品種與日本櫻島大根蘿卜進行正反交，以研究遠緣雜交的親和性，試驗結果表明，蘿卜與油菜的遠緣雜交存在嚴重的生殖障礙。甘彩霞等[13]將蘿卜與大頭菜，張鳳銀等[14]將蘿卜與小白菜進行屬間雜交，其后代具體表現為莢果長到一定程度后黃化，雜種胚胎開始敗育。如果采用原生質體融合技術則在一定程度上可克服雜交育種中諸如不親和性、性器官敗育障礙等問題。

3 誘變育種技術與蘿卜遺傳育種

3.1 誘變育種技術

誘變育種技術是人為利用物理或化學因素來處理種子、植株、組織、細胞或花粉，使其基因型產生遺傳變異，從中選擇培育新品種的方法。在眾多育種技術中，誘變育種因其突變頻率較高、突變譜較寬、能有效創造新類型種質資源，且突變性狀穩定較快，有利于加速新品種選育進程等優勢，在作物育種中得到廣泛應用，并且取得了極大成功；同時通過誘變技術獲得的一系列新穎突變種質資源也是進行功能基因研究的重要基礎材料。

誘變育種技術包括輻射誘變、化學誘變和航天誘變3種。輻射誘變是指人為地利用物理誘變源，如離子束、γ射線、β射線、χ射線、中子等高能射線誘發作物產生突變，通過突變體的選擇和鑒定，直接或間接地育成可供生產利用的新品種。化學誘變是用化學誘變劑如甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）等烷化劑或堿基類似物等處理植物材料，通過與核苷酸中的磷酸、嘌呤、嘧啶等分子直接反應來誘發突變，從而引起植株形態特征的變異。航天誘變又稱空間誘變，是將供試誘變材料搭乘返回式衛星或宇宙飛船，送到距地球200～400 km的太空，利用空間宇宙射線的強輻射，在高真空、微重力和交變磁場等特殊環境中進行誘變處理，使供試材料產生有利變異，返回地面試種后繼續采用常規育種技術，從中選育出農作物新品種。航天誘變可以使作物本身染色體產生缺失、重復、易位、倒置等基因突變。

3.2 蘿卜誘變育種

誘變實際上是一個“無中生有”的技術，它在創造或改變單基因控制的特殊性狀方面具有獨特的優勢。蔬菜誘變育種始于20世紀50年代，70年代后期，隨著誘變育種技術與方法日趨成熟，育成的作物品種逐漸增多。近年來，我國科技工作者通過誘變技術已先后育成番茄、辣椒、甜瓜和黃瓜等蔬菜新品種。同屬十字花科的油菜誘變育種成績顯著，單采用60Co-γ射線處理干種子，先后育成了滬油 4號、111、73-103、秀油 1號，甘油 5號等新品種[15]。石淑穩等[16]用EMS處理甘藍型油菜小孢子再生的胚性培養物，獲得長角果和矮稈突變體。甘藍型油菜皖油518接受空間誘變后，回收種子SP2代表現出豐富的遺傳變異，其中包括早熟、長角、多分枝、矮化、黃籽等突變類型。另外，SP2代各株系間產量亦表現出明顯差異，為培育高產油菜新品種創造了豐富的遺傳資源。蘿卜誘變育種在我國起步較晚，目前只有少量資源經衛星搭載，如蘇州地方蘿卜良種梅李60天經神州一號搭載，返回地面后經多代系統選育，具備了產量高、品質好、生長速度快、抗病性強的特點。梁秋霞等[17]選取櫻桃蘿卜點點紅為材料，用低能Ar+注入其干種子后的生物學效應進行了研究，結果表明不同劑量的低能Ar+注入都會使種子發芽率、成活率及不同階段的生長和發育產生變異。可以預見，蘿卜誘變育種具有廣闊的前景。

4 分子標記技術與蘿卜遺傳育種

4.1 分子標記技術

分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態性的直接反映。與其他幾種遺傳標記——形態學標記、生物化學標記、細胞學標記相比，DNA分子標記具有的優越性有：大多數分子標記為共顯性，對隱性性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的；在生物發育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析；分子標記揭示來自DNA的變異；表現為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速。隨著分子生物學技術的發展，DNA分子標記技術已有數十種，廣泛應用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關系鑒別、基因庫構建、基因克隆等方面。

4.2 分子標記技術在蘿卜中的應用

據 Vavilov 1923-1931年、Darling-ton 1945年和1955年的調查認為，蘿卜起源于中亞西亞和中國[18]，世界各地均有種植，歐美主要栽種小型四季蘿卜，亞洲以大型蘿卜為主。中國栽培蘿卜歷史悠久，蘿卜種質資源十分豐富，我國現已收集保存的蘿卜資源有2 071份，研究這些資源的遺傳背景和關系是有效利用資源的前提[11]。

分子標記在蘿卜種質資源遺傳多樣性分析以及標記輔助選擇等方面得到應用。孔秋生等[19]用RAPD標記對收集保存的來源于不同國家和地區的代表性栽培蘿卜種質資源的遺傳多樣性進行探討性分析，認識其遺傳親緣關系，為大批量蘿卜種質資源的鑒定和分類以及資源的有效利用提供理論依據和技術指導。汪志偉等[20]以蘿卜恢復系和不育系配制雜交組合，并以174株個體組成的F2代分離群體作為恢復基因的標記群體。以分離群體的不育株和可育株分別建立不育池和恢復池，利用100個RAPD引物對兩池間的多態性進行研究。結果顯示，標記OPC6 1900與蘿卜細胞質雄性不育恢復基因連鎖，可用于對育性恢復基因的標記輔助選擇。趙麗萍等[21]應用SRAP與AFLP兩種分子標記技術進行了蘿卜品種鑒定分析。龔義勤等[22]、宋賢勇等[23]、武創等[24]對蘿卜基因組 DNA的 RAMPPCR分析體系進行優化，并初步將體系應用于蘿卜品種遺傳多樣性和種質鑒定分析，為蘿卜種質資源晚抽薹、CMS恢復基因、肉質根形成等重要性狀標記與分子育種提供重要技術基礎。徐文玲等[25]采用AFLP結合銀染檢測技術，對與蘿卜耐抽薹基因連鎖的AFLP標記進行了篩選，結果以EcoRI-ACT/MseI-CTG和EcoRI-ACG/MseI-CAG兩對引物組合在抗感池中分別篩選出175 bp和123 bp的兩個標記CTG180和CAG120。譚婷婷等[26]利用蘿卜包含ORF138基因片段的Ogura胞質雄性不育（CMS）分子標記對收集的5份蘿卜雄性不育系種子材料進行鑒定，結果表明有1份種質為Ogura雄性不育材料，將Ogura分子標記應用于蘿卜Ogura細胞質雄性不育基因的轉育工作中，可以提高選擇效率，縮短育種年限。張庶等[27]利用cDNA-AFLP技術研究了蓮座期的福山包頭大白菜、翹頭青蘿卜及其雜種F1代的葉片，獲得特異表達的轉錄片段（TDF），從而為深入研究大白菜雜種優勢相關基因和蘿卜-大白菜基因組互作奠定了基礎。

5 基因工程技術與蘿卜遺傳育種

5.1 基因工程技術

基因工程技術是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉入新的宿主細胞，構建成基因工程菌（或細胞），實現遺傳物質的重新組合，并使目的基因在工程菌內進行復制和表達的技術。運用基因工程技術，可以改良植物品質，進行植物抗蟲、抗病、抗寒、抗旱、抗除草劑的研究。

荊贊革等[28]根據GenBank中擴展蛋白序列設計特異引物，從蘿卜高代自交系NAU-LVYH06中克隆到一個擴展蛋白基因 RsEXPB1（GenBank accession No.GQ387363，GQ387364），該基因主要在蘿卜生育前期的幼葉、肉質根木質部和韌皮部中表達，且表達豐度可能與該部位細胞生長分裂狀態相關。潘大云等[29]報道了將蘿卜抗線蟲基因導入油菜的研究結果。鄧曉東等[30]進行了蘿卜抗真菌蛋白基因Rs-AFPs轉化番茄的研究。李文君等[31]發表了蘿卜葉綠體ATP酶β亞基的cDNA克隆及序列特征的研究結果。王玲平等[32]以蘿卜品種圓白為材料，根據白菜CYP450基因CYP86MF保守序列設計引物，利用RT-PCR和5'/3'RACE相結合的方法克隆了一個CYP450基因的cDNA全長序列，并對它進行了序列分析，為CYP450基因的分離克隆及其在植物發育代謝中的功能研究提供一定的信息；丁云花等[33]開展蘿卜D染色體在7號連鎖群定位的研究，證實了定位有抗線蟲基因HsIRapls的7號連鎖群對應于具線蟲抗性效應的蘿卜D染色體；何啟偉等[34]采用RT-PCR的方法，先后從蘿卜花蕾中克隆了蘿卜花青素調控基因和開花關鍵基因LFY基因片段，并將后者構建了dsRNA抑制雙元表達載體pPOK-A-I-S-L，轉入到蘿卜品種短葉13中，獲得了T0代種子。

6 結語

我國蘿卜種質資源豐富，類型和品種繁多，且有多種食用方法。同時，蘿卜富含淀粉酶、硫代葡萄糖苷、VC、萊菔子素，以及其他維生素和多種礦物質，有藥用價值和保健作用，是頗受歡迎的保健食品。目前，除東亞國家大面積種植蘿卜外，國際上其他國家則只有少量栽培，品種類型也少。因此，調整和把握好育種目標，改進和提高育種技術水平，育成各具特色，優質、抗病、穩產、適應性廣的品種，并繁育出優質種子，不僅能夠加快國內品種更新，而且完全有條件推向國際市場。

可以預見，分子標記技術和原生質體融合技術等現代生物技術在蘿卜育種中將有更大的應用空間。傳統育種技術仍是重要的育種手段，現代生物技術與傳統育種技術相結合，必將大大加快蘿卜育種進程，創造出更多優異的種質資源，培育出更多優良性狀的蘿卜新品種。例如，采用小孢子培養技術，加快育種材料的純合過程，并配合強化室內和田間主要經濟性狀的鑒定、選擇，縮短優良親本系選育年限。對耐抽薹性、耐寒性、耐熱性等主要經濟性狀進行分子標記研究，輔助常規親本系及雜種一代的鑒定與選擇，提高選擇的效率和準確性。運用基因工程，轉化特異基因，創新蘿卜種質，利用原生質體融合技術、誘變技術豐富育種材料。

[1]Liehter R.Efficient yield of embryoids by culture of isolated microspores of diferentBrassicaceaespecies [J].Plant Breeding，1989(103)：119-123.

[2]Takahata Y,Komatsu H,Kaizuma N.Microspore culture of radish (Raphanus sativusL.):influence of genotype and culture conditions on embryogenesis[J].Plant cell Report,1996,16:163-166.

[3]張麗.蘿卜游離小孢子培養技術初探[J].園藝學報，2004，31（5）：676-678.

[4]付傳翠，張麗，宮國義，等.不同預處理方式對蘿卜小孢子活力的影響[J].華北農學報，2006（6）：45-48.

[5]陳文輝，方淑桂，曾小玲，等.蘿卜游離小孢子培養研究初報[J].福建農業學報，2006（4）：338-341.

[6]周志國，王聰艷，龔義勤，等.蘿卜小孢子植株倍性鑒定研究[J].江蘇農業科學，2009（4）：156-158.

[7]熊秋芳.蘿卜小孢子培養技術體系的構建及再生植株研究[D].武漢：華中農業大學，2008.

[8]孟金陵.蕓薹屬植物遠緣雜交不親和性的研究進展[J].中國油料，1987（4）：71-77.

[9]雷開榮，Ryschka U.不同供體原生質體前處理方法對甘藍與蘿卜屬間原生質體融合植株再生的影響[J].西南農業學報，1999，12（4）：5-10.

[10]孫振久.不同電融合條件對甘藍與蘿卜細胞融合效果的影響[J].西北農業學報，1993（2）：20-22.

[11]徐利遠，羅鵬，蘭澤蘧，等.甘藍型油菜與藍花子遠緣雜交及雙二倍體的合 成研究[J].遺傳學 報，1996，2（2）：124-130.

[12]胡大有，王愛云，李栒.蘿卜與甘藍型油菜和黑芥的遠緣雜交親和性研究[J].作物研究，2006（2）：124-126.

[13]甘彩霞，何云啟，崔磊，等.蘿卜與大頭菜屬間雜種胚的離體培養[J].長江蔬菜，2011（8）：18-20.

[14]張鳳銀，梅時勇，甘彩霞，等.蘿卜與小白菜屬間雜交的初步研究[J].江漢大學學報：自然科學版，2010（4）：70-72.

[15]馮學金，劉根科.現代生物技術在油菜種質資源創新中的應用[J].中國農學通報，2010，26（12）：13-17.

[16]石淑穩，吳江生，劉后利.離體誘發甘藍型油菜長角果和矮稈突變體[J].核農學報，1995，9（4）：252-253.

[17]梁秋霞，曹剛強，黃群策，等.低能Ar+注入櫻桃蘿卜點點紅種子后的生物學效應[J].中國農學通報，2005（3）：70-73.

[18]周長久，陳惠明.中國栽培蘿卜（Raphanus sativusL.var.longipinuatus Bailey）分布及起源中心的初步研究[J].北京農業大學學報，1991，17（4）：47-52.

[18]陳惠明，周長久.蘿卜酯酶同工酶與品種親緣關系的研究[J].湖南農業大學學報：自然科學版，1999，25（3）：191-193.

[19]孔秋生，李錫香，向長萍，等.蘿卜種質資源親緣關系的RAPD 分析[J].植物遺傳資源學報，2004，5（2）：156-160.

[20]汪志偉，向長萍，梅時勇，等.蘿卜細胞質雄性不育恢復基因的 RAPD標記[J].植物遺傳資源學報，2004（2）：153-155.

[21]趙麗萍，柳李旺，龔義勤，等.蘿卜品種指紋圖譜SRAP和AFLP 分析[J].植物研究，2007（6）：687-693.

[22]龔義勤，李培，王明霞.蘿卜基因組DNA的RAMP-PCR體系優化[J].植物研究，2006（1）：93-97.

[23]宋賢勇，柳李旺，龔義勤，等.蘿卜基因組DNA RAPD與ISSR-PCR 反應體系優化[J].種子，2007（2）：1-5.

[24]武創，司龍亭，姜晶.蘿卜ISSR-PCR反應體系的正交設計優化[J].分子植物育種，2010（1）：186-190.

[25]徐文玲，王淑芬，牟晉華，等.蘿卜抽薹基因連鎖的AFLP和SCAR分子標記鑒定 [J].分子植物育種，2009（4）：743-749.

[26]譚婷婷，劉立鋒，陳偉，等.利用分子標記鑒定蘿卜細胞質雄性不育種質的研究[J].山東農業科學，2011（8）：8-13.

[27]張庶，李利斌，王鳳德，等.利用cDNA-AFLP分析大白菜、蘿卜及其雜交種差異表達基因[J].山東農業科學，2011（7）：1-4，8.

[28]荊贊革，柳李旺，龔義勤.蘿卜擴展蛋白基因RsEXPB1克隆與表達特征分析[J].分子植物育種，2009（4）：801-805.

[29]潘大云，Friedt W.蘿卜抗線蟲基因導入油菜的研究[J].中國油料作物學報，1999，21（3）：6-9.

[30]鄧曉東，費小雯，胡新文.蘿卜抗真菌蛋白基因Rs-AFPs在大腸桿菌中的表達及其轉化番茄的研究[J].園藝學報，2001，28（4）：361-363.

[31]李文君，范靜華，趙南明，等.蘿卜葉綠體ATP酶β亞基的cDNA克隆及序列特征[J].清華大學學報：自然科學版，2001，41（4）：36-40.

[32]王玲平，曹家樹，葉紈芝，等.蘿卜RsCYP86MF基因cDNA全序列克隆及結構特征分析[J].園藝學報，2005，32（1）：127-130.

[33]丁云花，Holger B，Herbert P.蘿卜 D染色體在 7號連鎖群的定位研究[J].中國農學通報，22（5）：68-71.

[34]何啟偉，王淑芬，王文玲，等.我國蘿卜育種現狀與前程展望 [C]//中國園藝學會十字花科蔬菜分會第六屆學術研討會暨新品種展示會論文集，2008.

[35]何啟偉.十字花科蔬菜優勢育種[J].北京：農業出版社，1993.

[36]汪隆植，何啟偉.中國蘿卜[M].北京：科學技術文獻出版社，2005.