共振瑞利散射光譜法同時測定手性對映體的研究進展

楊季冬楊 瓊周 尚

（1.重慶三峽學院化學與環境工程學院，重慶萬州 404100）

（2.長江師范學院化學化工學院，重慶涪陵 408100）

共振瑞利散射光譜法同時測定手性對映體的研究進展

楊季冬1,2楊 瓊2周 尚2

（1.重慶三峽學院化學與環境工程學院，重慶萬州 404100）

（2.長江師范學院化學化工學院，重慶涪陵 408100）

自然界廣泛存在具有手性的有機對映異構體，還有很多人工合成的手性化合物．這些手性化合物的物理化學性能相似相近，但其旋光性、生物活性和環境行為迥然各異．對這些有機對映體的手性識別和分離分析則是分析化學中很有吸引力的課題．人類對手性化合物的認識和手性識別經歷了感性和理性的飛躍，尤其是對其手性識別從操作到理論分析，產生了許多手段和方法．但是適應不同要求的分離分析仍然在快速發展，尤其是不經分離而同時測定手性對映體的方法還在不斷探索中．筆者擬用高靈敏度的共振瑞利散射光譜法為主的分子光譜分析方法進行深入研究，擬建立一種快速簡捷高效的同時測定手性對映體的現代分析方法．

手性對映體；手性識別；同時測定；共振瑞利散射光譜法

1 引 言

有機對映異構體在自然界廣泛存在，包括人工合成的眾多手性化合物．對這些有機對映體的手性識別和分析，尤其是不經分離就同時測定是分析化學的前沿性研究課題．目前外消旋手性對映體的醫藥和農藥的生產和使用已相當普及，無論是天然提取或人工合成的，在全球市場銷售與臨床使用的約有50%屬于外消旋手性對映體藥物（chiral enantiomer drugs），[1]（35）手性對映體農藥（chiral enantiomer pesticides）也占40%以上．這些共存的手性對映異構體藥物，其生物活性具有顯著差別，對其藥理藥效則產生顯著的影響；手性對映體農藥不僅對靶標的生物活性表現出顯著差異，而且對非靶標的環境行為迥然不同．[2]因此對外消旋手性對映體藥物的分離分析和測定一直受到分析化學家的關注，這方面的研究工作雖已取得很大的進展，但仍有許多值得深究和可觀的發展前景．[3]手性對映體（chiral enantiomer）是自然界存在的普遍現象，組成蛋白質的天然氨基酸都是L-構型，而天然的糖類則大多數為D-構型，DNA的螺旋構型都是右旋，人們也發現海螺的螺紋是右旋的，纏繞植物也是右旋居多．在它們的作用過程中具有很強的立體專一性，有很強的鏡像對稱規律．如人工合成的D-構型氨基酸會有什么樣的性質和生理活性？由這樣的氨基酸組成的多肽和蛋白質有什么樣的生理作用？人工合成的L-構型的糖類又會有什么不同的性能？左旋肉堿的減肥作用很受女士們的青睞，而右旋肉堿又有些什么不同的作用呢？所有這些問題的探索和進展，無疑將為分子水平上揭開生命中的種種奧秘鋪筑道路．而對于無論天然的或人工合成的手性藥物，大量人工合成的手性農藥，均存在相當部分的外消旋對映體，這些對映異構體的性能和藥理藥效的差異已逐漸為人們所認識．如何檢測外消旋對映體的存在或檢測手性對映體藥物及農藥的光學純度，尤其是不經分離而同時測定手性對映體藥物或農藥，則對生產質控、用藥安全和進一步的藥理研究具有更重要的意義．

手性是物質的一種自然屬性．所有物質均可分為手性的和非手性的兩大類：一個物體，如果不能與其鏡像疊合，即實物和其鏡像不同，則稱其具有手性；相反，一個物體，其實物與鏡像可以重疊，則稱其為非手性的．許多物質是具有手性的，人類的手即具有典型的手性，無論左手或右手放到鏡子前出現的鏡象總是相對的右手或左手，這左手和右手呈鏡象對稱卻不能重疊．在生活中人們發現海螺的螺紋和纏繞植物的旋轉方向都是手性的，后來的科學發現蛋白質、多糖、DNA和酶這些組成生命的基石——生物大分子都是具有手性的．從分子水平上講，手性都源自于手性分子．一個碳原子如結合四個不同的原子或基團，稱為不對稱碳原子，含有不對稱碳原子的分子就有可能具有手性；具有一個不對稱碳原子的分子，存在一個鏡象的分子，兩者呈鏡象對稱不疊合，互稱為手性對映體．手性對映體的物理化學性質都極其相似，唯有不同的是旋光作用不同，其中一個旋光若是左旋的，而另一個則必然是右旋的．前面講的手性物質都是具有不同的旋光性的，地球上人類的DNA都是右旋光的，人們試曾設想在外星球是否存在其DNA為左旋的靈智似人類的動物呢？作為含有多個不對稱碳原子的有機分子中，若其不對稱碳原子為偶數個，則其旋光性可能在分子內相互抵消，這就是內消旋分子；若其不對稱碳原子為奇數個，則勢必存在另一個旋光相反的對映體，此為外消旋對映體，即如這樣的對映體等量存在同一體系中，則總體反映無旋光．對外消旋對映體的手性識別一直是研究的熱點，目前人為的手性拆分的研發手段和方法很多，也很有成效，然而人為的手性識別卻是很困難的，如不須分離而同時測量和表征手性對映體，或者測定某一手性物質的光學純度是相當不易的．然而在自然界對手性對映體的識別是很容易的，因為自然機體中的生物大分子本身的手性對手性對映體的區分符合其自然法則．

2 手性對映體的研究意義

有機對映體呈鏡像對稱，其物理化學性能都相似相近，但卻有不同的生物活性．手性對映體藥物常常具有不同的藥效和毒副作用，其中之一對映體不僅缺乏藥效而且有很強的毒性和副作用．這是由于生物體系內部的受體如酶、核酸、蛋白質和多糖等生物大分子具有與其功能相適應的手性結構，不同對映體藥物進入生物體后，其生物化學反應、藥理作用和代謝途徑可能不同，其生物活性、藥效和毒副作用就會各不相同．例如鎮靜劑Thakidomide（反應停），其有效成分是（R）型，具有良好的鎮靜作用，而它的（S）型則具有胚胎毒性和致畸作用；Verapamil（異搏停）的（S）型與（R）型在人體內的代謝速率具有顯著的立體選擇性差異．目前常用藥物中約占一半以上為外消旋對映體，即為兩種光學異構體的等量混合物，其中一種為有藥效的優勢對映體，另一種則為劣勢對映體．[4]為了用藥的安全有效，有必要對手性藥物的各個異構體分別進行考察，了解各自的生物活性．美國（FDA）及許多發達國家的藥政管理組織已明確規定，[5]要求申報手性藥物時，必須對不同異構體的生理作用和毒理學數據以及各占比例提供清楚的報告．手性農藥的對映異構體具有不同的生物活性（殺蟲、除草、殺菌活性等），同時對映異構體間還存在毒性、降解或代謝及殘留等不同的環境行為．常見三類手性農藥是擬除蟲菊酯殺蟲劑，苯氧丙酸類除草劑和唑類殺菌劑，它們其中的單個異構體具有較強的生物活性．如廣泛使用的除草劑異丙甲草胺（metolachlor），其S-構型的對映體對靶標雜草的活性比R-構型的對映體高10倍以上；殺菌劑甲霜靈（metalaxyl）的殺菌活性則都是來源于R-構型的對映體．同時，手性農藥對非靶標環境的作用亦體現出顯著差異．如1S-聯苯菊酯（1S-cis-bifenthrin）的內分泌干擾的效應遠高于1R-聯苯菊酯，而1R-聯苯菊酯對靶標生物的活性則顯著高于1S-聯苯菊酯，這表明1R-聯苯菊酯是一個安全高效的構型．因此手性藥物或農藥的分離分析及其分別測定在分析測定任務中就占有很重要的地位，然而由于手性對映體的物理化學性質幾乎完全相同，利用常規的分離分析手段無法實現對它們的分離，未經分離而同時測定則更是無能為力，因此分析化學界和藥學界一直致力于探索分離分析手性對映體藥物的新原理和新方法．

目前常用的分離分析手性對映體的技術手段是色譜法和毛細管電泳法，[6,7]以及利用掃描探針技術（STM）和原子力顯微技術（AFM）實現手性分子的識別．[8]一般采用直接和間接兩種途徑，均為先分離后分析．直接法系采用手性固定相和手性流動相添加劑兩種操作：手性固定相法是基于樣品與鍵合到載體表面的手性選擇劑間結合，形成暫時的非對映絡合物，按其能量差或穩定性不同從而達到手性分離；手性流動相添加劑法則是通過對映體與添加到流動相中的手性分子形成一對非對映的絡合物，由于非對映絡合物的穩定性、在流動相中溶劑化作用或絡合物與固定相的鍵合等性質的差異而得到分離．間接法是將手性對映體混合物與光學純的手性試劑反應，生成兩個非對映異構體，然后用常規的色譜方法分離，對分離出的衍生產物進行分析測定，或再經還原分別得到原來的對映異構體后測定．這兩種方法均不簡便且增大分析成本．

3 手性對映體同時測定的意義

如果要在特定情況下實現對生產流程的質控檢測中簡捷快速得出結果，對某些手性對映體藥物進行快速簡便的痕量分析，則以不經分離而同時測定左、右旋兩種異構體為最理想．目前進行這方面研究工作的報道還很少見，而依托超分子體系的識別能力和光、電信號傳遞功能對手性對映體進行拆分和分別測定已有報道，其中大都采用冠醚、環糊精、大環多胺、環番、穴芳烷、杯[n]芳烴、卟啉等大環超分子體系作為手性選擇試劑，還有以聯萘、多環芳烴、蛋白質及酶、Cu(II)絡合物等具有光學活性基團且與手性對映體作用的手性光學探針．[9]如文獻[10]研究發現D、L-色氨酸對映體在β-環糊精存在下呈現顯著不同的手性包絡差異，這種差異與酸度和溫度密切相關；可實現色氨酸對映體的手性識別熒光同時測定．文獻[11]報道在BAS體系中以芘為微環境光學探針，并以時間分辨熒光探針技術實現了不經分離識別D、L-色氨酸對映體并同時測定．這兩項研究一是利用超分子體系的手性識別能力，即在形成不同的環糊精包合物的選擇性以及其增溶、增敏作用加強了光學差異；二是在蛋白質手性體系中與手性的微環境光學探針作用產生強熒光，再分別與左、右旋的色氨酸作用后導致不同程度的熒光猝滅，反映出一定的熒光壽命差異，因而反映在光譜上有可檢測的差異信號．但用熒光法識別手性藥物本身或者反應產物必須具有熒光，這在一定程度上限制了方法的應用范圍．

而直接利用共振瑞利散射（RRS）分析和非線性共振散射（RNLS）分析方法進行手性對映體的同時測定尚未見文獻報道．RRS和RNLS光譜分析是近年發展起來的新分析技術，由于RRS兼具散射和電子吸收光譜的雙重特性，它既與分子中電子在入射光電磁場作用下發生受迫振動有關，又受電子能級躍遷的影響，因此形成了一種新的光譜特征，因而它能夠對研究分子結構和形態、電荷分布、鍵合性質以及反應特征等提供更豐富的信息．特別是它對生物大分子之間或生物大分子與小分子之間的非鍵作用，如締合、聚集、偶極－偶極作用、疏水作用、長距離組裝等作用十分敏銳，從而成為某些生物大分子的表征和測定及反應歷程研究的一種非常有用的技術．RNLS是由共振瑞利散射引起的一種共振非線性散射，研究發現在入射光波長的1/2倍和2倍處也能產生強烈的倍頻散射（Frequency-doubling Sacattering，FDS）和二級散射（Second Order Scattering，SOS）．由于這些散射的波長位置、強度變化等特征與一般的非線性光學現象一致，且與RRS存在相關性，伴隨著RRS的產生和強弱變化而同步變化，彼此之間存在強烈的依存關系．[12](280)隨著RRS分析技術的應用研究日益擴展，此技術在核酸、蛋白質、多糖等生物大分子[13]分析離子締合物測定痕量物質，[14]有機化合物和藥物分析方面也有更多的研究和應用，[15]還在納米微粒的研究中也得到新的應用．[16]最近我們的研究表明某些有機化合物的異構體或同系物、某些手性對映體藥物及其反應產物能表現出不同的RRS和RNLS光譜特征和不同的強度變化，例如用共振瑞利散射光譜法測定β-環糊精與鹽酸普魯士卡因和β-環糊精與氯霉素的包結常數；[17]又如用RRS同時測定兩種吩噻嗪藥物（CPZ和PZ）；[18]還有利用色氨酸的手性D、L-對映體，[19]萘酚的α-和β-異構體[20]等產生不同的共振瑞利散射光譜特征，從而對兩種異構體進行識別和同時測定．表明了RRS和RNLS識別不同的手性異構體的可行性和潛在的應用價值．與熒光法識別手性藥物相比，RRS光譜法不受藥物或農藥及其反應產物必須具有熒光的限制．由于多數藥物本身并無熒光，因此RRS可能具有更廣泛的應用范圍．然而迄今RRS和RNLS技術在藥物或農藥手性識別的研究方面剛剛起步，雖已取得初步的研究成果，但尚應進一步深入研究．可以預料，這是一個極有應用前景和開發價值的新的研究領域．

4 手性對映體同時測定的發展

綜上所述，利用RRS和RNLS光譜分析技術，探索有機對映異構體手性識別的新原理．

1）通過試驗大環或籠狀化合物（冠醚、環糊精、大環多胺、環番、穴芳烷、杯[n]芳烴、卟啉等）與外消旋的氨基酸類、含苯環的羧酸類、酯類、磺酸類等小分子類的手性對映體藥物或農藥形成超分子體系的反應，以篩選出合適的超分子體系的手性選擇性試劑．

2）通過試驗具有光學活性基團的手性光散射探針試劑（聯萘及其衍生物、多環芳烴、大分子抗生素、蛋白質及酶等生物大分子、Cu(II)等金屬絡合物）與外消旋的烯烴類、多環芳香烴類，以及含硫、含磷化合物等大分子類手性對映體藥物或農藥相互作用形成非對映異構體的復合物，以篩選出合適的手性微環境光散射探針試劑．

通過研究手性藥物或農藥形成手性超分子體系或非對映體復合物體系的反應機理和過程，探索RRS和RNLS光譜特征、穩定環境和控制條件，發展手性對映體手性識別的新技術．針對不同的手性藥物或農藥反應體系的RRS和RNLS光譜的特征變化和信號差異，同時結合紫外光譜、圓二色譜、時間分辨和偏振熒光、紅外光譜等多種分子光譜方法的驗證，充分利用多元回歸圖解法、主因子分析法、偏最小二乘法、小波分析法以及“同原射線計量分析”[19-20]等化學計量學的輔助，建立同時測定外消旋手性對映體藥物或農藥的新方法，實現對外消旋手性對映體藥物或農藥不經分離的同時測定，實現手性農藥的質量控制與分析，建立多種常用手性農藥光學異構體純度，或確定其對映異構體在環境中的比率的分析方法．不僅擴展和深化共振光散射技術的新分析應用，而且拓展了手性藥物或農藥的手性拆分和手性識別的新途徑．因此這是一項有重要意義的前沿性研究課題，這不僅是分析化學學科發展的需要，也是適應社會發展的需要．

[1]尤啟冬，林國強.手性藥物——研究與應用[M].北京:化學工業出版社，2004.

[2] Yan Zhou, Wen-Hua Wang, Wei Dou, Xiao-Liang Tang, Wei-Sheng Liu. Synthesis of a new C2-symmetric chiral catalyst and its application in the catalytic asymmetric borane reduction of prochiral ketones[J]. Chirality, 2008,20(2): 110.

[3] Lumei Wang, Weiping Liu, Caixia Yang, Zhiyan Pan, Jianying Gan, Chao Xu, Meirong Zhao and Daniel Schlenk. Enantioselectivity in Estrogenic Potential and Uptake of Bifenthrin[J]. Environmental Science & Technology, 2007, 41 (17): 6124.

[4] Jessica M. Zeleke, Gregory B. Smith, Heike Hofstetter. Oliver Hofstetter. Enantiomer separation of amino acids in immunoaffinity micro LC-MS[J]. Chirality, 2006,18(7): 544.

[5] Dongri Jin, Avvaru Praveen Kumar, Goon-Cheol Song and Yong-Ill Lee. Determination of thyroxine enantiomers in pharmaceutical formulation by high-performance liquid chromatography–mass spectrometry with precolumn derivatization[J]. Microchemical Journal, 2008, 88(1): 62.

[6] Fernando de Andrés, Gregorio Casta?eda, ángel Ríos. Achiral liquid chromatography with circular dichroism detection for the determination of carnitine enantiomers in dietary supplements and pharmaceutical formulations[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010, 51(2): 478.

[7] Bunleu Sungthong, Pavel Já? and Gerhard K.E. Scriba. Development and validation of a capillary electrophoresis method for the simultaneous determination of impurities of escitalopram including the R-enantiomer[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2008, 46(5): 959.

[8] Sergi Garcia-Manyes and Fausto Sanz. Nanomechanics of lipid bilayers by force spectroscopy with AFM: A perspective, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 2010, 1798 (4): 741.

[9] Pu L.. Fluorescence of Organic Molecules in Chiral Recognition[J]. Chemical Reviews, 2004, 104 (3): 1687.

[10]謝劍煒，翟言強.環糊精超分子體系的手性識別研究[J].高等學校化學學報，1997，18（9）:1447.

[11]衛艷麗，魏玉霞，Carmen W Hu，等.手性生物分子識別新進展[J].廣西師范大學學報：自然科學版，2003，21（1）:155.

[12]劉紹璞.分析化學新進展[M].北京：科學出版社，2002.

[13] Juan-Juan Peng, Shao-Pu Liu, Lei Wang and You-Qiu He. Studying the interaction between CdTe quantum dots and Nile blue by absorption, fluorescence and resonance Rayleigh scatteringspectra[J]. Spectrochimica Acta Part A: 2010,75(5): 1571.

[14]劉江濤，劉紹璞，劉忠芳.博萊霉素銅配合物-DNA體系的共振瑞利散射及分析應用[J].中國科學：B輯，2010，40（4）：372.

[15] Zhengwen Liua, Shaopu Liua, Lei Wanga, Juanjuan Penga and Youqiu He. Resonance Rayleigh scattering and resonance non-linear scattering method for the determination of aminoglycoside antibiotics with water solubility CdS quantum dots as probe[J]. Spectrochimica Acta Part A: 2009, 74(1):36.

[16] Peili Chen, Xiaoli Hu, Shaopu Liu, Zhongfang Liu and Yanqi Song. Study on the resonance nonlinear scattering spectra of the interactions of promethazine hydrochloride and chlorpromazine hydrochloride with 12-tungstophosphoric acid and their analytical applications[J]. Spectrochimica Acta Part A: 2010, 77(1): 207.

[17] NianBing Li, HongQun Luo, ShaoPu Liu. Resonance Rayleigh scattering study of the inclusion complexation of chloramphenicol with β-cyclodextrin[J]. Talanta, 2005, 66 (2): 495.

[18]張書然，楊季冬.共振瑞利散射光譜法對鹽酸異丙嗪與鹽酸氯丙嗪的同時測定[J].分析測試學報，2009，28（12）:1362.

[19]楊季冬.用RRS光譜和“同原射線計量分析法”同時測定D-和L-色氨酸對映異構體[J].分析科學學報，2006，22（4）：454.

[20]楊季冬.共振瑞利散射光譜法同時測定α-萘酚和β-萘酚異構體[J].化學通報，2008（7）：539.

（責任編輯：張新玲）

Abstract:Chiral organic enantiomers and synthetic chiral compounds exist widely in nature. The physical and chemical properties of these chiral compounds are very similar, but the optical activity, bioactivity and environmental action are dramatically different. The chiral recognition and separation and analysis of these organic enantiomers are a very attractive topic in the analytical chemistry field. The identification and recognition of the chiral compounds have experienced the perceptual and the rational leap, especially in the operation and theoretical analysis of chiral compounds’ recognition, many means and methods were developed. The separation and analysis for adapting to the different requirements are still in rapid development; especially the methods of simultaneously determined chiral enantiomers without the separation are still in continuous exploration. The high sensitivity method of molecular spectral analysis of resonance Rayleigh scattering spectra will be adopted in our future research, and a simple and efficient and rapid determination of chiral enantiomers modern analysis method will be established.

Keywords:chiral enantiomers; chiral recognition; simultaneous determination; resonance rayleigh scattering spectral method

Research Progress on Simultaneous Determination of Chiral Enantiomers by Resonance Rayleigh Scattering Spectral method

YANG Ji-dong1,2YANG Qiong1ZHOU Shang1
(1. School of Chemistry and Environmental Engineering, Chongqing Three Gorges University, Wanzhou, Chongqing, 404100; 2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Yangtze Normal University, Fuling, Chongqing, 408100)

O657.3

A

1009-8135（2012）03-0090-05

2012-03-20

楊季冬（1956-），男，重慶豐都人，教授，博士，博士生導師，主要從事分子光譜分析研究.

本文系國家自然科學基金項目（No.21175015）研究成果之一