單純孕激素口服避孕藥對大鼠催乳素水平及垂體催乳素細胞的影響

黎海莉，潘 瑩，申 薇，杜 鵑，康 林*，崔慧先

（1.河北醫科大學第四醫院婦產科，河北石家莊 050011；2.河北醫科大學

基礎醫學院人體解剖學教研室，河北石家莊 050017）

·論 著·

單純孕激素口服避孕藥對大鼠催乳素水平及垂體催乳素細胞的影響

黎海莉1，潘 瑩2，申 薇1，杜 鵑2，康 林2*，崔慧先2

（1.河北醫科大學第四醫院婦產科，河北石家莊 050011；2.河北醫科大學

基礎醫學院人體解剖學教研室，河北石家莊 050017）

目的探討單純孕激素口服避孕藥左旋18-甲基炔諾酮（levonorgestrel，LNG）對大鼠垂體催乳素（prolactin，PRL）細胞形態以及血清濃度的影響。方法正常雌性SD大鼠分為長期給藥組和停藥組，應用免疫組織化學和透射電鏡方法，觀察大鼠垂體PRL細胞形態變化并檢測PRL的血清濃度。結果長期給藥組PRL免疫反應陽性細胞數目增多（P＜0.01）、面積增大（P＜0.05），血清PRL升高（P＜0.01），電鏡下可見PRL細胞高爾基復合體發達、粗面內質網豐富，合成與分泌旺盛。停藥后各項觀察指標接近正常。結論應用LNG可引起大鼠垂體PRL細胞的形態、PRL的合成與分泌及血清PRL濃度的改變，但這一過程是可恢復的。LNG使血清PRL濃度升高，對排卵有一定抑制作用。

避孕藥，口服，激素；垂體；催乳素；大鼠

單純孕激素口服避孕藥，對哺乳期婦女和想使用口服形式避孕的婦女，是一種很好的避孕方法選擇［1］。目前，涉及下丘腦-垂體-卵巢軸反饋調節機制的研究報道，多集中于生殖藥理學、生化學與臨床研究方面，缺乏單純孕激素避孕藥對下丘腦-垂體-卵巢軸反饋調節的形態學資料。我們實驗組一直致力于這方面的研究，在單純孕激素避孕藥左旋18-甲基炔諾酮（levonorgestrel，LNG）的長期作用下，可使大鼠下丘腦促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）陽性神經元形態發生改變，LNG使下丘腦GnRH神經元的功能處于非活躍狀態［2］。下丘腦神經肽Y神經元、下丘腦弓狀核的雌激素受體參與了LNG長期作用下GnRH分泌的調節［3］，在垂體水平，我們還證實LNG可逆性的反饋調節黃體生成素（luteinizing hormone，LH）細胞的形態［4］。由于催乳素（prolactin，PRL）水平的升高能使生殖機能減退，許多研究者觀察了避孕藥與高催乳素血癥的關系。但是，迄今為止仍未取得一致的結果［5-6］。LNG是否通過影響垂體催乳素細胞而發揮其反饋調節作用尚未見報道。本文應用免疫組織化學、透射電鏡等技術，在垂體水平探討LNG對PRL細胞的形態及血清PRL濃度的影響，以期為臨床避孕藥物的應用提供形態學資料。

1 資料與方法

1.1 動物及分組：選用健康成年雌性SD大鼠23只，體質量200～250g（河北省實驗動物中心提供），自然光照、室溫（22±3）℃、自由飲食飲水飼養。大鼠隨機分為實驗組與對照組，實驗組大鼠分為長期實驗組7只（喂藥90d）和停藥實驗組7只（停藥后繼續普通喂養20d）。實驗組大鼠每天上午9時左右灌胃服用溶于食用麻油的LNG 50mg·kg-1· d-1，對照組（9只）灌服等量食用麻油。

1.2 取材及切片：依據陰道涂片結果，分別將處于動情期的實驗組及其相應對照組的大鼠稱質量，心臟取血后迅速使用4%多聚甲醛經主動脈行灌流固定，靜置1h。所取心臟血樣，室溫下低速離心（2 000r/min）20min，-20℃備用待測。取垂體入Bouin液固定12h，常規脫水透明，石蠟包埋，用組織切片機從垂體頭側向尾側做冠狀連續切片，片厚4μm，切片裱于涂有多聚賴氨酸的載片上。每例垂體連續集片于10組載玻片（同一載玻片相鄰2張切片間隔40μm）［4］，入37℃溫箱內干燥24h，備用。

1.3 免疫組織化學法：常規石蠟切片脫蠟至水、依次進入0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4），3%過氧化氫（甲醇稀釋）常溫孵育，10%正常山羊血清、豚鼠抗大鼠PRL抗體（由協和醫科大學提供，磷酸鹽緩沖液1∶4 000稀釋），4℃冰箱過夜。生物素標記的1∶100兔抗鼠IgG（由北京中山生物技術有限公司提供），37℃溫箱、濕盒內孵育30min。1∶100辣根過氧化物酶的鏈霉卵白素（由北京中山生物技術有限公司提供），37℃溫箱、濕盒內孵育30min。用DAB-H2O2顯色3min，自來水停顯，脫水，透明，中性樹膠封固。

1.4 電鏡取材及觀察：實驗動物斷頭后，迅速取其垂體，將其切成直徑1mm的細塊，浸入2.5%戊二醛磷酸緩沖液（pH 7.6）中室溫固定48h，PBS沖洗，再入1%鋨酸后固定1h，PBS沖洗，丙酮逐級脫水，Epon812包埋，LKB-Ⅴ型超薄切片機切片，片厚約50nm。切片用枸櫞酸鉛及醋酸雙氧鈾染色，日立H-7500型透射電子顯微鏡觀察。

1.5 計算機圖像分析：根據大鼠垂體冠狀切面上，前葉、中間葉和后葉出現的形態學特征，每只大鼠分別在垂體頭端部、中間部和尾端部選擇典型切片［4］。應用ZL-2000型計算機圖像分析系統在相應切片上測定單位視野內（0.01mm2）PRL細胞的個數及其面積，平均灰度和形狀等參數。

1.6 血清PRL濃度測定：應用美國德普公司自動化學發光免疫分析儀（IMMULITE系統）及原裝試劑盒測定血清PRL濃度［4］。

1.7 統計學方法：應用SAS8.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PRL細胞的免疫組織化學觀察結果：大鼠腺垂體PRL免疫反應陽性細胞的胞質呈淺黃色，細胞形態呈不規則形，常單個分布于細胞索內，細胞多靠近毛細血管，或有細長突起至毛細血管附近（圖1A）。長期實驗組單位視野內PRL細胞個數為（2.68±0.35）個，多于長期對照組的（1.11±0.14）個，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖1B，C）。停藥實驗組（1.39±0.19）個，同停藥對照組（1.21± 0.13）個相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。停藥實驗組同長期實驗組相比，細胞數目減少，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖1D）。長期實驗組PRL細胞面積為（156.85±22.66）μm2，大于長期對照組的（114.91±22.04）μm2，差異有統計學意義（P＜0.01）。停藥實驗組（126.16±22.64）μm2，同停藥對照組（129.55±15.83）μm2相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。停藥實驗組同長期實驗組相比，面積減小，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 腺垂體超微結構觀察結果：PRL細胞的胞質內含有卵圓形或不規則形顆粒，直徑500～700nm，胞質內還含有許多平行排列的粗面內質網、小泡及高爾基復合體。實驗組大鼠PRL細胞呈合成與分泌旺盛的表現，細胞核核膜清晰，常染色質豐富；胞漿內分泌顆粒較少，顆粒大小不等，高爾基復合體發達，常圍在一起，形成大圈狀；粗面內質網豐富，常呈同心圓排列（圖2）。

2.3 血清PRL濃度測定結果：長期實驗組（18.62±3.84）mU/L同對照組（10.89±1.82）mU/L相比，血清濃度升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。停藥實驗組（10.11±1.39）mU/L同對照組（11.74±1.94）mU/L相比，差異無統計學意義（P＞0.05），而同長期實驗組相比，血清PRL濃度下降，差異有統計學意義（P＜0.01）。

3 討 論

甾體避孕藥的避孕機制是多環節的，其中抑制排卵是避孕作用的關鍵所在。正常的排卵依賴于下丘腦-垂體-卵巢軸的精密調控，其主要通過GnRH對LH和卵泡刺激素（follicle-simulating hormone，FSH）分泌的調控來實現［2-4］。但是，甾體避孕藥對生殖過程的影響是綜合性的，由于PRL水平的升高能使生殖機能減退。Shaaban等［7］發現使用Norplant埋植劑的婦女，半年后血清PRL升高。而Diaz等［8］對使用Norplant埋植劑婦女的血清PRL進行了縱向比較，并未發現顯著差異。Spellacy等［9］觀察到釋放低劑量孕酮IUD可顯著提高PRL水平，而含銅IUD卻無此作用。Mishell等［10］發現長期和短期應用復方或單純孕激素避孕藥的婦女，血清PRL水平升高。但也有學者［11］觀察到，低劑量雌二醇配伍LNG或地索高諾酮的復方片不影響血清PRL水平。迄今為止，這項研究仍未取得一致的結果。本實驗中觀察到，大鼠應用LNG后，長期實驗組大鼠血清PRL升高，考慮PRL的升高參與了LNG對下丘腦-垂體-卵巢軸的調控作用。事實上，有報道［12］PRL可通過中樞及卵巢2條途徑，對下丘腦-垂體-卵巢軸功能產生影響。PRL可作用于下丘腦-垂體軸，調控FSH的基因表達；高水平PRL可通過短路反射刺激下丘腦分泌多巴胺增多，抑制下丘腦GnRH的合成與釋放，LH分泌下降，使機體不能形成排卵前的雌激素高峰和LH峰，并直接抑制卵巢合成雌二醇和孕酮，干擾受精和胚胎發育［13-15］。LNG是第2代全合成孕激素類藥物，為19-去甲基-睪酮的衍生物，19位甲基被取代，17位增加乙炔基，是強有力的孕激素。本實驗中觀察到，大鼠應用LNG后，長期實驗組大鼠垂體PRL細胞變大、數量增多。電鏡下可見到胞漿內分泌顆粒減少，高爾基復合體發達，粗面內質網豐富，常呈同心圓排列。如此結果表明，PRL合成、分泌旺盛，使血清PRL濃度升高，這可能對抑制大鼠排卵起一定的作用。但是，由于基礎PRL血清濃度的波動范圍很大，并且其分布趨向于右斜，如果取血時間不同，加之實驗對象年齡、種屬的不同以及避孕藥物組成和劑量的差異，都會使情況趨于復雜化，其具體機制有待進一步探討。本實驗觀察到停藥后，大鼠PRL細胞的形態、細胞分布與大小，都逐漸接近正常情況，血清激素濃度也逐步恢復正常水平。我們認為，應用LNG對腺垂體細胞形態和內分泌活動的影響是暫時的，停藥后可恢復正常。實際上，長期應用避孕藥的婦女，在停藥后能恢復生育能力，這在臨床上已得到驗證。本實驗從形態學等方面，進一步驗證了這類藥物的可恢復性。（本文圖見封二）

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（本文編輯：劉斯靜）

THE EFFECTSOF PROGESTIN-ONLY CONTRACEPTION ON THE PRL LEVEL AND THE MORPHOLOGICAL CHANGE OF THE PITUITARY PRL CELLS IN RATS

LIHaili1，PAN Ying2，SHENWei1，DU Juan2，KANG Lin2*，CUIHuixian2
（1.Department of Obstetricsand Gynecology，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，
Shijiazhuang 050011，China；2.Departmentof Anatomy，the School of Basic Medical Sciences，HebeiMedical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo investigate the morphological alternations of prolactin（PRL）cells and the serum concentrations of PRL in levonorgestrel（LNG）-treated rats.MethodsThe normal female SD ratswere divided into long-term treated group and drug withdrawal group.The pituitary PRL cells were identified by immunohistochemistry and transmission electron microscope（TEM）method.The serum concentrations of PRL were measured by IMMULITE automated analyzer.ResultsIn long-term treated group，the number andmean areas of PRL cells increased（P＜0.01，P＜0.05）and the shape became irregular.Golgi complex and rough endoplasmic reticulum became very developed and the secretory granules with various size and shape decreased.The serum concentrations of PRL were significantly higher in treated group than those of control group（P＜0.01）.After drug-withdrawal，these observation indexes recovered to normal gradually.ConclusionLNG causes changes ofmorphology of PRL cells and concentrations of PRL，but these changes can return to normal after ceasing treatment.The antiovulation of LNG is various and complex and involve in the increase of the serum concentrations ofPRL.

contraceptives，oral，hormonal；pituitary gland；prolactin；rats

R979.21

A

1007-3205（2012）06-0621-04

2012-05-19；

2012-05-31

河北省科技廳博士基金課題（04547002D-3）

黎海莉（1974-），女，河北邯鄲人，河北醫科大學第四醫院副主任醫師，醫學博士，從事生殖內分泌疾病以及婦科腫瘤診治研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.06.001