云芝糖肽聚氰基丙烯酸正丁酯納米囊的制備工藝優選＊

吳 柱，李建明，肖海英，馬 寧

(長沙醫學院，湖南 長沙 410219)

云芝糖肽(polysaccharpetide，PSP)是從擔子菌綱多孔菌科云芝屬真菌云芝或培養的菌絲中提取的水溶性大分子多糖類，具有抗腫瘤[1－5]、抗乙型肝炎病毒[6－7]、鎮痛[8]等作用。云芝糖肽對肝臟有很好的生物活性，臨床上被廣泛應用于治療乙型病毒性肝炎，并作為肝癌的輔助治療藥物。但云芝糖肽干膏的引濕性強，現有制劑多為片劑、膠囊等口服制劑，存在吸收不佳、生物利用低、穩定性不強等問題。筆者擬將云芝糖肽制成載藥納米囊，并對界面聚合法制備云芝糖肽聚氰基丙烯酸正丁酯納米囊(PSP－PBCA－NC)的工藝進行了初步優選，報道如下。

1 儀器和試藥

AG285型電子天平(梅特勒－托利多上海有限公司)；Seastar星海旋轉蒸發器(寧波科生儀器廠無錫市星海王生化設備有限公司)；KS－6000型超聲清洗儀(寧波科生儀器廠)；納米粒度分析儀Zetasizer 1000HSA(Malvern)；752型紫外可見分光光度計(上海光譜)；L8－80M型低溫超速離心機(美國Beckman公司)。相對分子質量在7萬～15萬的云芝糖肽精品，由云芝糖肽粗粉提純；氰基丙烯酸正丁酯(廣州白云醫用膠總公司)；泊洛沙姆188(由沈陽藥科大學提供)；苯酚、硫酸、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、磷鎢酸均為分析純。

2 方法與結果

2.1 納米囊制備

將氰基丙烯酸正丁酯、乙酸乙酯溶解于丙酮，混合均勻，作為有機相；將云芝糖肽、泊洛沙姆188溶于水，混合均勻，作為水相。將有機相在磁力攪拌下以低速均勻滴加到水相中，約2 h滴加完畢，再繼續磁力攪拌2 h，得含云芝糖肽的聚氰基丙烯酸正丁酯納米囊混懸液，于35℃真空旋轉蒸發，除去有機溶劑并將整個體系濃縮，得均勻的不含有機溶劑的PSP－PBCA－NC混懸液。

2.2 包封率測定

本試驗中，采用離心法提取后，通過紫外可見分光光度法測定包封率[9－10]。精密量取PSP－PBCA－NC混懸液1mL，低溫超速(4℃，18 000 r/min)離心1 h，取下層沉淀，用1mL甲醇溶解，超聲30min，低溫超速離心20min，取上層清液，在490 nm波長處測定，得納米囊內總糖量(W1)。另精密量取PSP－PBCA－NC混懸液0.2mL，以甲醇0.8mL溶解，超聲30min，低溫超速離心20min，取上層清液，在490 nm波長處測定，得混懸液中總糖量(W2)。采用苯酚硫酸法反應，在490 nm波長處測定云芝糖肽總糖量[2005年版《中國藥典(二部)》附錄ⅣA]。包封率(%)=(W1/ 5W2)×100%。

2.3 正交試驗

按單因素試驗初選的制備條件和工藝，以包封率為考察指標，選取藥物與氨基丙烯酸正丁酯用量比(因素A)、乙酸乙酯與氨基丙烯酸正丁酯用量比(因素B)、油水兩相比(因素C)、轉速(因素D)為主要影響因素，各因素分別取3個水平，按正交試驗表L9(34)設計各因素水平，對PSP－PBCA－NC的制備工藝進行優化。因素水平表見表1，正交試驗方差分析見表2。可見，4個因素對結果的影響均顯著，最佳處方工藝組合為A1B3C1D3。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗方差分析結果

2.4 處方工藝參數與驗證試驗

正交試驗確定的最佳處方工藝為A1B3C1D3，即氰基丙烯酸正丁酯用量為0.1 mL，藥物用量為20 mg，乙酸乙酯用量為2 mL，油水兩相比為1∶1，轉速為18 000 r/min。根據最佳處方工藝制備3批PSP－PBCA－NC樣品，測定平均包封率，結果為83.7%。

2.5 粒徑測定

取適量PSP－PBCA－NC樣品，稀釋后用激光粒度分析儀進行掃描，粒徑度分布見圖1。結果平均粒徑為268.5 nm，粒徑分布范圍為203.7～312.6 nm。

圖1 PSP－PBCA－NA粒徑分布圖

2.6 掃描電鏡觀察

將PSP－PBCA－NC用1.5%磷鎢酸染色，以掃描電鏡觀察其形態，結果見圖2。可見PSP－PBCA－NC為球形實體，表面有一層薄薄的聚氰基丙烯酸正丁酯膜。

3 討論

3.1 溶劑對納米囊粒徑分布的影響

試驗中篩選出非質子性溶劑丙酮作為有機溶劑。若選用質子性溶劑如乙醇，制得的云芝糖肽納米囊出現兩種粒徑分布，這是由于質子性溶劑的陰離子XO－與水的OH－分別作為聚合反應的引發劑，從而造成粒徑分布不均。

圖2 PSP－PBCA－NA掃描電鏡圖

3.2 表面活性劑對納米囊粒徑分布的影響

單因素篩選試驗中，曾選擇吐溫80作為表面活性劑，結果納米囊容易聚集，導致粒徑變大。吐溫80能降低納米囊表面張力，使納米囊聚集，粒徑變大。

3.3 有機溶劑含量對納米囊粒徑分布的影響

采用界面聚合法制備的PBCA－NC體系中含有有機溶劑，需通過濃縮將其除去，同時以提高納米囊在懸浮液中的含量。經試驗，室溫條件下納米囊穩定，且濃縮后粒徑分布更趨均勻。這是由于有機溶劑丙酮具極好的水溶性，能向水相均勻擴散，可使制成的包囊結構不緊密，粒徑較大。

[1]OoiVE，Liu F.Immunomodulation and anti－cancer activity of polysaccharide－protein complexes[J].Curr Med Chen，2000，7(7)：715－729.

[2]Ng TB.A review of research on the protein－bound polysaccharide

(polysaccharopeptide，PSP) from the mushroom Coriolus Versicolor (Basidiomycetes：Polyporaceae)[J].Gen Pharmac，1998，39(1)：1－4.

[3]Wasser SP.Medicinal mushroom as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides[J].Microbiol Biotechnol，2002，60(3)：258－274.

[4]Iguchi C，Nio Y.Plant polysaccharide PSK：cytostatic effects ongrowth and invasion；modulating effect on the expression of HLA and adhesion molecules on humangastric and Colonic Tumor cell surface[J].Anticancer Res，2001，21(21)：1 007－1 013.

[5]曾淑君，沈寶蓮，文良珍，等.復方云芝糖肽對裸鼠人鼻咽癌抗癌作用研究[J].中藥藥理與臨床，1994，10(5)：35－36.

[6]宋子賢，梁世文，伍學泉，等.云芝糖肽膠囊治療慢性乙型肝炎臨床觀察[J].廣西醫學，2000，22(6)：424－425.

[7]符孔舟，王清江，楊海平.云芝菌膠囊聯合雙嘧達莫片治療兒童慢性乙型肝炎的療效分析[J].時珍國醫國藥，2005，16(8)：804－805.

[8]殷偉平，龔 珊，蔣紅星，等.云芝糖肽的鎮痛作用及其機理的初步分析[J].中成藥，2002，24(1)：41－43.

[9]張 強，廖工鐵.硫酸慶大霉素聚氰基丙烯酸正丁酯毫微球制備工藝研究[J].中國藥學雜志，1996，31(1)：24－27.

[10]劉月新，譚牛仔，田育望，等.吡喹酮聚乳酸納米粒制備工藝研究[J].中南藥學，2008，6(6)：641－644.