殼聚糖絮凝法精制黃精水提取液

於　娜，黃　山

(青島科技大學化工學院，山東 青島 266042)

黃精指百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygonatum)的黃精(P.sibiricum Del.ex Red.)、滇黃精(P. kingianumColl. et Hemsl.)和多花黃精(P.cyrtonem a Hua)等3種植物的干燥根莖[1]。黃精含有黃精皂苷、煙酸、糖類、醌類和氨基酸等元素，具有明顯的提高免疫系統功能、抗衰老、降血糖和降血脂等藥理作用[2]。黃精多糖已被證明具有良好的保健功能，因此對黃精多糖的研究具有重要的科學價值。采用傳統精制工藝醇沉法需要消耗大量乙醇，生產成本高，且有效成分易損失。

殼聚糖為甲殼素的脫乙酰產物，自然資源豐富，生物相容性好[3]，可用于粗多糖水提取液的除雜精制，主要是與其吸附性能和絮凝作用有關。殼聚糖通過分子內氫鍵產生吸附作用[5]，能有效地除去粗多糖水提取液中的懸浮雜質顆粒和蛋白質膠體等不穩定成分和物質，有效地保留多糖成分。

為了在純化過程中盡量保留浸出液的有效成分，采用單因素試驗和正交設計法，以黃精多糖保留率和除雜率為指標，對黃精提取液精制工藝進行了研究，優選出殼聚糖絮凝法的最適宜工藝條件，并對殼聚糖絮凝法對粗多糖的除雜精制與普通醇沉法進行了對比。

1　試驗儀器與材料

UV1000紫外分光光度計，北京萊博泰科儀器有限公司；電子恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；FA1104電子天平，上海金科電子天平有限公司；攪拌器，常州國華電器有限公司；離心機，天津市泰斯特儀器有限司；pHS-25型pH計，上海精科雷磁儀器廠；DM型控溫電熱套，山東鄄成華魯儀器廠。

黃精，亳州市亳廣中藥飲片有限公司(批號 20081206)；殼聚糖，上海偉康生物制品有限公司；硫酸，質量分數為98%，萊陽市康德化工公司；乙醇，質量分數為95%，煙臺三和化學試劑有限公司；氫氧化鈉，天津市北方天醫化學試劑廠；蒽酮，上海化學試劑采購供應五聯化工廠；鹽酸，萊陽市康德化工有限公司。

2　試驗方法與結果

2.1　黃精水提液中粗多糖的含量測定

2.1.1標準曲線的制備

2.1.1.1葡萄糖對照品溶液的制備

精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.1 g，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度(1 g/L)，搖勻，備用。

2.1.1.2黃精水提液的制備

稱取黃精藥材100 g，加水煎煮2次。第1次加入10倍量水煎煮2 h，第2次加入8倍量水，煎煮1 h。2次的濾液合并，減壓濃縮至規定濃度備用。

2.1.1.3殼聚糖溶液的配置

量取5 mL冰醋酸溶液，加水至500 mL配成體積分數為1.0%的冰醋酸溶液。稱取5 g殼聚糖于上述冰醋酸溶液中，制成質量分數為1.0%的殼聚糖溶液，充分溶脹后作為絮凝劑備用。

2.1.1.4殼聚糖絮凝黃精水提液

量取黃精水提液適量，調pH值至規定值，加入一定量殼聚糖溶液，攪拌10 min，在一定水浴溫度中放置一段時間，離心15 min(3 000 r/min)，過濾，取濾液備用。

2.1.1.5蒽酮-硫酸試劑的制備

精密稱取0.2 g蒽酮，溶于100 mL質量分數為72%硫酸中(須臨用新配)。

2.1.1.6標準曲線的制備及線性關系的考察

精密量取對照品溶液(濃度為1.0 g/L)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL，分別置10 mL具塞刻度試管中，沿試管壁分別加入5 mL的2.1.1.4中制備的蒽酮-硫酸試劑，混勻，蓋上玻璃塞在沸水浴中加熱10 min，取出，在流水中冷卻20 min后取出，以空白試劑調零照紫外-可見分光光度法在625 nm波長處測定的吸收度A。以吸收度為縱坐標，對照品濃度c(g·L-1)為橫坐標，經線性回歸處理得到標準曲線的回歸方程為：A=0.530 2c+0.025 1，R2=0.999 8，結果見圖1。

圖1　葡萄糖標準曲線圖Fig.1　Calibration of glucose concentration

2.1.2評定指標

殼聚糖絮凝方法主要對粗多糖提取液進行除雜精制，所以其評價指標是多糖保留率和除雜率。

2.1.2.1除雜率的計算

精密量取2.1.1.2項下黃精水提液和2.1.1.4項下絮凝后溶液各10 mL，置干燥至恒重的蒸發皿中水浴蒸干，于105 ℃干燥至恒重，稱重并計算浸膏得率，從而求出除雜率(%)，見式(1)。

(1)

2.1.2.2多糖保留率的計算

精密量取2.1.1.2項下黃精水提液和2.1.1.4項下絮凝后溶液各2 mL，測定吸收度A，求出粗多糖的濃度，計算粗多糖得率，從而求出多糖保留率(%),見式(2)。

(2)

為了綜合考察殼聚糖絮凝除雜作用，既要求多糖保留較多又要除雜效果較好。本試驗采用綜合評定的方法對除雜率和多糖保留率進行評定綜合評定，見式(3)。

綜合評分(%)=保留率(%)×0.7+除雜率(%)×0.3

(3)

2.2　單因素考察的篩選

2.2.1絮凝劑加入量的考察

分別量取40 mL黃精水提液，加水稀釋至m(黃精)∶V(水提液)為2∶10(g∶mL)，調節pH值為2.0，加入藥液體積5%、10%、15%、20%和25%的質量分數為1.0%的殼聚糖絮凝劑，置于35 ℃恒溫水浴中，絮凝2 h，在300 0 r/min的轉速下離心10 min，取上清液20 mL，測定除雜率，取原液與上清液各2 mL，求出多糖保留率，計算綜合評分。結果見表1。

表1　絮凝劑用量(以藥液體積為基準)對綜合評分的影響Table 1　Effect of flocculant dosage on the composite score

從絮凝劑加入量的結果中可以看出：隨著殼聚糖加入量的增加，綜合評分先增加后減少。在絮凝劑的加入量為藥液體積15%時，綜合評分最高。殼聚糖對多糖的沉降作用主要是靠殼聚糖對多糖的吸附作用，殼聚糖是大分子的物質，它的吸附主要是靠吸附架橋和電中和。當絮凝劑加入量過小時，絮凝劑沒有完全和雜質分子進行吸附；當絮凝劑加入量過大時，絮凝劑與雜質分子過于飽和，反而影響了殼聚糖的雜質吸附[6]，所以將絮凝劑的加入量作為正交試驗的考慮因素。

2.2.2溫度因素的考察

按2.2.1中的試驗條件和方法，分別于30、35、40、45、50和55 ℃的恒溫水浴中，測定除雜率；取原液和上清液各2 mL，測定多糖含量，求出多糖保留率，計算綜合評分。結果見表2。

表2　溫度對綜合評分的影響Table 2　Effect of temperature on the composite score

從表2中可以看出：隨著溫度升高，除雜率先上升后下降，多糖保留率先下降后上升，綜合評分為先上升后下降的趨勢，且在45 ℃時綜合評分最高。溫度過低，絮凝劑的活性受到影響，溫度過高，絮凝劑容易老化，在45 ℃絮凝效果最好。

2.2.3藥液濃度因素的考察

按2.2.1中的條件，僅改變m(黃精)∶V(水提液)分別為2∶10、3∶10、4∶10、5∶10和6∶10(g∶mL)，測定除雜率和測定多糖含量，求出多糖保留率，計算綜合評分。結果見表3。

表3　藥液濃度對綜合評分的影響Table 3　Effect of liquid concentration on thecomposite score

從表3中可以看出：隨著藥液濃度增大，除雜率現上升后下降，多糖保留率先下降后上升，綜合評分為先上升后下降的趨勢，且當黃精水提液質量體積比為4∶10(g∶mL)時，綜合評分最高。當藥液濃度過大時，可能是絮凝劑大分子分散，影響了絮凝劑的絮凝效果。可將黃精水提液質量體積比為4∶10(g∶mL)的藥液濃度定為最適宜濃度。

2.2.4pH值因素的考察

按2.2.1中的條件，僅改變pH值分別至2.0、3.0、4.0、5.0和6.0，取上清液20 mL，測定除雜率；取原液和上清液各2 mL，測定多糖含量，求出多糖保留率，計算綜合評分。結果見表4。

表4　pH值對綜合評分的影響Table 4　Effect of pH value on the composite score

從表4中可以看出：隨著pH值增大除雜率先增加后減小，多糖保留率呈先下降后上升，綜合評分為先上升后下降的趨勢，且當pH值為4.0時綜合評分最高。在酸性條件下去除率較堿性條件下高，這可能與多糖提取液中雜質在弱酸性條件下呈陰離子型有關[7]。pH值過小或者過大，都影響了殼聚糖的活性，pH值選擇4.0為宜。

2.2.5絮凝時間因素的影響

按2.2.1中的條件，僅改變絮凝時間分別為1、2、3、和5 h，在3 000 r/min的轉速下離心10 min，取上清液20 mL，測定除雜率；取原液和上清液各2 mL，測定多糖含量，求出多糖保留率，計算綜合評分。結果見表5。

表5　時間對絮凝綜合評分的影響Table 5　Effect of the flocculation time on thecomprehensive evaluation

由表5的結果可知：除雜率隨著絮凝時間增加而逐漸增加，多糖保留率則呈逐漸下降的趨勢。考慮到經濟效益，確定絮凝時間選擇1～3 h。

2.3　正交試驗

2.3.1正交試驗及結果

根據單因素試驗的篩選結果，殼聚糖絮凝法精制黃精水提液工藝條件可初步優化為：m(黃精)∶V(水提液)為4∶10(g∶mL)，絮凝劑用量為藥液體積的15%，絮凝的pH值為4.0，絮凝溫度45 ℃，絮凝3 h。延長時間會降低生產效率，因此優選絮凝時間為3 h。

綜上，確定以藥液濃度(A)、絮凝劑用量(B)、pH值(C)和溫度(D)4個因素，每個因素選3個水平進行正交試驗。因素及水平見表6，按照L9(34)的正交計劃表進行，正交試驗結果見表7，正交分析結果見表8。

表6　正交試驗因素水平表Table 6　Factors and levels of orthogonal test

綜合分析及結論：由方差和極差分析結果可知，影響殼聚糖絮凝的因素依次為：RA>RD>RB>RC。因素(A)和因素(D)對殼聚糖絮凝有顯著影響，因素(C)對殼聚糖絮凝影響較少；因素中A的KⅡ>KⅢ>KⅠ；B的KⅡ>KⅢ>KⅠ；C的KⅡ>KⅠ>KⅢ；D的KⅠ>KⅡ>KⅢ。所以殼聚糖最適宜絮凝工藝是A2B2C2D1：m(黃精)∶V(水提液)為4∶10(g∶mL)，絮凝劑用量為藥液體積的15%，絮凝的pH值為4，絮凝溫度為40 ℃。

表7　正交試驗結果Table 7　Results of orthogonal test

表8　正交方差分析Table 8　Analysis of variance

2.3.2最適宜提取工藝重現性試驗

按正交試驗所確定的最適宜提取工藝，分別量取40 mL水提液3組，m(黃精)∶V(水提液)為4∶10(g∶mL)，調節pH值為4.0，置于40 ℃恒溫水浴中，加入15%藥液體積的質量分數為1.0%的殼聚糖溶液，絮凝3 h，在3 000 r/min的轉速下離心10 min，取上清液20 mL，測定除雜率；取2 mL的上清液，求出多糖保留率，結果見表9。

表9　重現性試驗的結果Table 9　Reproducibility of test results

從驗證試驗可以看出，最適宜殼聚糖絮凝工藝的綜合評分都高于正交表里任何一組，說明該最適宜工藝穩定可行。

2.4　普通醇沉法和殼聚糖絮凝法的比較

量取40 mLm(黃精)∶V(水提液)為4∶10(g∶mL)的黃精水提液，在快速攪拌下加入95%的乙醇150 mL，室溫靜置24 h后，真空抽濾溶解濾渣至40 mL，取20 mL測定除雜率，測定多糖含量，求出保留率計算綜合評分。同法量取40 mL的水提液藥液，按照殼聚糖絮凝法正交優化最適宜絮凝工藝處理，測定除雜率和多糖保留率，結果見表10。

從表10可以看出，普通醇沉法的除雜率較高，達到49.75%。但多糖保留率較低僅為60.34%，綜合評分僅為57.16，綜合評分太低不符合粗多糖精制的要求。殼聚糖絮凝法的除雜率為16.08%，多糖保留率為88.42%，綜合評分為66.72，符合粗多糖精制的要求。綜上所述殼聚糖絮凝法對粗多糖的除雜精制比普通醇沉法的效果明顯，不僅除去了雜質，而且盡可能多保留多糖。

表10　不同精制方法的比較Table 10　Comparison of different purification methods

3　結論

殼聚糖絮凝方法的最適宜絮凝條件是：m(黃精)∶V(水提液)為4∶10(g∶mL)，，絮凝劑的用量為藥液體積的15%，絮凝的pH值為4，絮凝溫度40 ℃，絮凝3 h。用殼聚糖絮凝法進行精制的多糖的保留率為88.42%，除雜率為16.08%，綜合評分較高，為66.72%，比普通的醇沉法好，符合粗多糖精制的要求，且穩定性較好。殼聚糖絮凝法可以較好的對黃精水提液進行除雜、精制，有利于黃精有效成分在中藥制劑中的應用。

參考文獻：

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