中藥水蛭生藥學與化學成分的研究進展與展望

劉曉帆 楊瑤珺 吳麗潔 徐佳

水蛭是一味傳統藥材，始載于《神農本草經》，歷代本草對它均有記錄。近年來，由于人們發現其對心腦血管疾病具有很好的治療作用，在臨床上，也越來越多的用于腦血栓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及腦水腫的治療[1]。另據報道，水蛭亦可以用于糖尿病腎病的治療[2]。因此，水蛭的臨床研究及藥學研究也越來越廣泛, 現就生藥學近年來的研究概況綜述如下。

1 原動物品種的研究

《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)2010年版收載3種水蛭，分別為蛭科動物螞蟥WhitmaniapigraWhitman、柳葉螞蟥WhitmaniaacranulataWhitman，水蛭HinudonipponicaWhitman的干燥體[3]。

需要指出的是，《中國藥典》和《中國動物志》所記載的這三種水蛭在名稱及歸屬上面有很大的不同，《中國動物志》將螞蟥WhitmaniapigraWhitman、柳葉螞蟥WhitmaniaacranulataWhitman分別稱作寬體金線蛭與尖細金線蛭，屬于黃蛭科。而水蛭HinudonipponicaWhitman稱為日本醫蛭，屬于醫蛭科[4]。它們的習性也完全不同，前兩者以田螺、蚌類等軟體動物為生，后者則以吸食血液為生。有報道稱后者具有抗凝血作用，而前兩者未見有這種作用的報道。

綜合歷代本草及近年來水蛭的動物研究進展，筆者認為，《中國藥典》的來源欠妥。根據歷代文獻對水蛭的性狀、生存環境、食性等方面的描述，歷代本草所記載的水蛭應為吸血的日本醫蛭或麗醫蛭(屬于醫蛭科)，而不應該是不吸血的寬體金線蛭和尖細金線蛭[5]。另外，《中國藥典》將寬體金線蛭稱之為“螞蟥”亦不太恰當，“螞蟥”一名始出于《圖經本草》，原意是指吸血的水蛭，直到今天，人們也將吸血的蛭類稱作螞蟥。同理，柳葉螞蟥也應改稱為尖細金線蛭為妥。

2 水蛭藥材鑒定研究

目前報道了一系列關于水蛭藥材鑒定方面的研究，主要包括：性狀鑒定、理化鑒定等方面，顯微鑒定、DNA條形碼部分未見報道。

2.1 性狀鑒別

在藥材市場上，水蛭有三種規格，分別為：清水曬干、清水燙死、礬水殺死。在價格上呈現遞減趨勢，至于三種規格的質量如何，未見有文獻報道。但大部分學者認為，質量較好的水蛭在性狀上應有以下特征：外觀背部有自然的黑色光澤，折斷時有韌性感，斷面有膠質樣光澤，味淡且有魚腥氣，手摸肉質有彈性[6-7]。筆者在進行市場調查時發現，寬體金線蛭為主要品種，清水曬干和清水燙死這兩種規格占主導地位。

2.2 顯微鑒定

目前沒有關于顯微鑒定的專門文獻報道，不過張貴君[8]在《常用中藥顯微鑒定》一書中指出水蛭的粉末鑒別特征為纖維、表皮細胞與縱肌纖維細胞。但是根據筆者的驗證發現，水蛭正品與偽品在這些方面幾乎一模一樣，無法進行鑒別。該方法只能用于水蛭類藥材與其他藥材的鑒別。

2.3 理化鑒別

《中國藥典》2010版的檢測方法為薄層色譜和浸出物含量的檢測。筆者經驗證發現，正品和混偽品均可以與標準藥材在相同位置形成相同的紫紅色的點，很難鑒別。浸出物的含量表明，在正品的范圍中，清水曬干的浸出物含量最高，清水燙死次之，礬制最低。與偽品的橫向比較未找出明顯差別。所以，很多學者就報道了其他的一些理化檢測方法，主要為毛細管電泳法。

江佩芬等[9]利用電泳技術，測定寬體金線蛭、日本醫蛭、尖細金線蛭、光潤金線蛭的電泳譜帶，發現寬體金線蛭和日本醫蛭的電泳譜帶相似，尖細金線蛭的電泳譜帶略有區別，光潤金線蛭的電泳譜帶與它們3種有些不同，但是這4種水蛭均有兩條主要電泳譜帶A3和B1。因為水蛭的主要成分是蛋白質，所以從化學成分的角度說，這4種水蛭可能存在有相同的蛋白質，但是以《中國藥典》收載的3個品種寬體金線蛭、日本醫蛭、尖細金線蛭的蛋白類成分較為相似。

另外，劉興國等[10]采用高效毛細管電泳法對寬體金線蛭和混淆品菲牛蛭進行蛋白多肽的分析，發現寬體金線蛭與菲牛蛭的高效毛細管電泳圖譜之間有明顯差異，重復性良好。

2.4 DNA條形碼驗證

DNA 條形碼技術是近來發展起來的物種鑒定新方法，通過對基因組中一段短的、標準的DNA片段進行分析從而對物種進行準確鑒定，成為生物分類和鑒定的研究熱點和方向。尤其適用于來源于生物體部分組織或器官的中藥材的真偽鑒定[11-12]。運用DNA條形碼，可以很好的對水蛭的品種進行快速、有效的鑒定。但是現在這方面還未見報道。

3 含量測定和指紋圖譜

《中國藥典》的水蛭的含量測定的方法是進行凝血酶效價的評價，通過這種評價方法可以大致了解水蛭凝血作用的強弱，這種整體評價方法符合中藥普遍存在的多成分、多靶點的特點。但是，經過筆者的驗證，發現這種方法存在無法判別何時開始凝結的問題，有著較大的誤差。

文獻報道方面，大多采用高效液相色譜和紫外光譜法來測定水蛭內各種有效成分的含量，其中包括：氨基酸、次黃嘌呤、黃嘌呤、總磷脂、總多糖、生物活性物質等等。

通過柱前衍生化法測定水蛭內氨基酸含量發現，水蛭內游離氨基酸含量和總氨基酸含量大多維持在2.9 mg/ml和4.1 mg/ml左右[13-14]。

丁冠華[15-16]采用Folch試劑超聲提取，鉬藍試劑顯色和乙醚回流提取，苯酚-硫酸顯色的方法，分光光度法分別測定兩種藥材不同商品中總磷脂和總多糖的含量。得出水蛭中總磷脂含量以磷含量計算，在2.38～71.4 μg范圍內具有良好的線性關系，其回歸方程Y=0.0238X-0.01(r=0.9994)。總多糖含量以葡萄糖計,在18.54～92.68 μg范圍內有良好線性關系,回歸方程Y=0.0045X+0.0012(r=0.9998)。

次黃嘌呤為最常見的水蛭含量測定的標準物質，但是次黃嘌呤的藥理作用為陣痛、止咳等，與水蛭主要的藥理作用差別很大，筆者認為，次黃嘌呤可能不能作為水蛭質量鑒別的標準品。

王艷[17]、張永太[18]等運用仿生酶水解、乙醇提取等提取方法，運用高效液相測定，均取得了良好的效果。但是含量較低，是否有鑒定依據，需要進一步的考察。

部分學者還對不同產地、不同品種的水蛭進行了指紋圖譜的研究，但是所運用的標準品只有次黃嘌呤，其他峰的歸屬還需要進一步的研究[19-20]。

4 化學成分研究

水蛭的化學成分以大分子蛋白質、多肽等物質為主。也是現在研究的主流范圍，而微量元素等小分子物質則研究較少。

4.1 蛋白質及多肽等大分子物質

目前文獻報道了一系列水蛭具有抗凝作用的多肽類成分，包括水蛭素、肝素、組織胺、氨基酸和其他多肽類物質等。并通過化學和藥理研究，基本否定了水蛭素為中藥水蛭(藥材)的有效成分，但是對于其有效成分的確定，還需要進一步的研究。

4.1.1 水蛭素 目前，人們對水蛭素的研究最為透徹。一百多年前，人們就發現了在水蛭提取物中有抗凝血的成分，上世紀50年代，Markwardt成功分離出這種物質，定名為水蛭素。顧銀良等[21]對它的組成進行了分析，發現它是含有66個氨基酸的單鏈多肽。長期以來，人們一直認為水蛭素是水蛭的有效成分，但是最近的研究表明，水蛭素只存在于新鮮水蛭的唾液中，且胃蛋白酶會破壞它的活性[22]。所以，在干燥藥材中水蛭素含量微乎其微，經過煎煮和人口服后，在水解作用和胃蛋白酶作用下，會損失殆盡。但是長期的臨床實踐表明，水蛭的常用方法的確為煎煮和口服，而且亦具有很好的抗凝血作用。因此，對于水蛭素是水蛭的有效成分的論調，筆者認為沒有科學依據。現在，研究人員已成功合成人造的重組水蛭素，用于科學研究，低濃度的重組水蛭素還用于心腦血管疾病的治療和預防。

4.1.2 氨基酸 水蛭含有17種氨基酸,包括人體必需的8種氨基酸，瞿新艷[23]通過觀察干燥的寬體金線蛭提取物對小鼠凝血、出血時間和家兔離體血漿復鈣時間的影響，發現水蛭低極性(石油醚提取)提取物可以延長小鼠凝血、出血時間和家兔的血漿復鈣時間。通過對水蛭低極性提取物的測定，發現提取物中游離氨基酸的含量豐富，因此推測游離氨基酸可能是水蛭抗凝血作用的主要有效成分。

4.1.3 其他大分子類成分 近年來，有文獻報道表明可從水蛭中分離得到具有較好抗凝活性的多肽類成分。比如，貴艷麗等[24]利用仿生親和介質庫進行配體篩選和1步純化的方法，從日本醫蛭中純化出了1種具有抗凝血活性的新型低豐度蛋白質，命名為NLP-1( new leech protein-1)。通過進一步分析, 其相對分子質量為13800，蛋白回收率可達到69.2%，在血漿中含量為0.02 mg/ml時即可產生明顯的抗凝血現象。鐘山等應用Sephadex DEAE A-50陰離子交換樹脂色譜、Sephadex G-25和Sephadex LH-20凝膠過濾色譜以及反相高效液相色譜對寬體金線蛭干體進行了分離純化，得到了一個抗凝血多肽，命名為“螞蟥多肽 (whitmamn)”，其相對分子量為8608，推測其結構為63個氨基酸殘基形成的肽鏈上連接一個分子量為1898的糖鏈[25-26]。

4.2 小分子成分

近年來，針對水蛭中的大分子成分進行了很詳盡的研究，下面討論一下近些年從水蛭中提取分離的小分子活性成分。

4.2.1微量元素 實驗研究表明，水蛭中含有Zn、Mn、Fe、Co、Cr、Se、Mo、Ni等14種元素[27]。閆繼東等[28]經過研究，認為水蛭可能通過調節病人體內微量元素變化引起的紊亂，從而達到治療疾病的作用。

4.2.2 其他小分子物質 目前，從水蛭中分離得到的小分子成分主要為喋啶類、糖脂類、不飽和脂肪酸和甾體類化合物等。鄭云楓等對寬體金線蛭的小分子成分進行研究，發現3種具有抗缺氧活性的喋啶類雜環新化合物，分別命名為水蛭甲素、水蛭乙素和水蛭丙素。李友賓等[29]從日本醫蛭中也得到3個喋啶類化合物:hirudinoidine A-C。這是首次從日本醫蛭中得到噻吩并喋啶結構的化合物。黃榮清等[30]運用氣質聯用技術，分析得出水蛭中有很強的抗凝血活性提取物中的15 個化合物，主要為不飽和脂肪酸甲酯、甾體等。其中含有：己醛、4-甲基十四烷酸甲酯、12-甲基十四烷酸甲酯、11-十六碳烯酸甲酯、14-甲基十五烷酸甲酯、11-甲基十六烷酸甲酯、14-甲基十六烷酸甲酯、十七烷酸甲酯、13-十八碳烯酸甲酯、十八烷酸甲酯、10-十九烯酸甲酯、13-二十二烯酸甲酯、2-乙酰氧基-7,9-十九烯酸甲酯、膽固醇、膽甾-5,7-二烯-3-酮。

5 總結與展望

通過對水蛭生藥學和化學成分研究的文獻調研，發現《中國藥典》關于水蛭品種存在描述不清，分類錯誤等問題。在藥材鑒定方面，傳統的鑒定方法僅僅可以在正品范圍內大致評價水蛭的質量，文獻報道也大多為此，但是無法鑒別正品與偽品。DNA條形碼可以很好的解決這個問題，但目前沒有相關報道。含量測定和指紋圖譜方面，由于標準品的缺乏和對水蛭有效成分研究的欠缺，現只能用次黃嘌呤和氨基酸來部分的判斷水蛭質量，缺乏依據。所以筆者初步認為，今后水蛭的研究重點應放在藥理方面，研究出究竟是什么成分在發揮抗凝血作用，只有這樣才能科學、有效的評價水蛭的質量。

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