毛細管電泳技術在蛋白質生物制品分析中的應用研究進展

曹衛榮,張世光,王曉婧,周青青,鄒 衛

(石藥集團中奇制藥技術(石家莊)有限公司,河北 石家莊 050051)

毛細管電泳(Capillary electrophoresis，CE)，又稱高效毛細管電泳(High-performance capillary electrophoresis，HPCE)，是近20年迅速發展的一種快速的分離分析技術[1]。毛細管電泳是以毛細管為分離通道，由高壓電場提供驅動力，根據待分析物質各組分在毛細管內淌度或分配系數的不同，即各組分沿管軸方向運動速度的差異來實現對組分的分離。與傳統的液相色譜相比，具有高效、快速、微量、操作簡便、經濟等優點[2～4]，利用毛細管電泳技術可以分離從離子到中性分子、從小分子到生物大分子等一系列物質，廣泛應用于化學、生物、醫學、環境科學等領域，被認為是當代分析科學最具活力的前沿研究領域。毛細管電泳技術已實現了納升水平分離分析，是繼高效液相色譜之后的分析化學史上又一重大進展。

蛋白質生物制品是當今生物醫藥產業的重要組成部分，近年來隨著DNA重組與克隆技術的飛速發展，重組蛋白類藥物的研發和生產成為了醫藥行業的熱門之一，但其分子量大、結構復雜，因此較難鑒別和定量分析，是阻礙其快速發展的主要因素。毛細管電泳技術用于蛋白質生物制品的分析具有明顯的優勢。作者在此就近年來國內外毛細管電泳技術在蛋白質生物制品分析中的應用研究進展進行了綜述。

1 毛細管電泳的演變

毛細管電泳最初始于瑞典籍生化學家Tiselius于1937年設計的一套分離蛋白質的電泳裝置，因其在血清蛋白分析上的斐然成就，Tiselius于1948年獲得諾貝爾化學獎[5]。20世紀80年代是毛細管電泳技術加速發展時期，先后出現了熔融石英毛細管、毛細管凝膠電泳、毛細管等電聚焦、膠束電動毛細管色譜、毛細管電色譜。1981年，Jorgenson和Luckas用石英毛細管進行電泳分析，促進電泳技術發生了根本變革，迅速發展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術[6]。1989年，第一臺商品化毛細管電泳儀問世。短短幾年內，由于毛細管電泳符合生命科學領域對多肽、蛋白質(包括酶、抗體)、核苷酸乃至脫氧核糖核酸(DNA)的分離分析要求，而得到了迅速發展。

2 毛細管電泳的分類

2.1 毛細管區帶電泳(Capillary zone electrophoresis，CZE)

CZE又稱自由溶液毛細管電泳，是目前毛細管電泳中最簡單、最基礎、應用最廣泛的電泳技術。CZE是以具有pH值緩沖能力的電解質溶液為載體，根據被分析物電泳淌度的不同實現分離。CZE的應用范圍寬，能分離小分子藥物、氨基酸、多肽類、對映體等帶電物質，但不能分離中性物質。

2.2 毛細管凝膠電泳(Capillary gel electrophoresis，CGE)

CGE是將板上的凝膠移到毛細管中作支持物進行的電泳。凝膠具有多孔性，起類似分子篩的作用，溶質按分子大小逐一分離。CGE對于大分子物質如抗體、蛋白多肽、寡聚核苷酸的分離分析，特別是DNA序列分析顯示了速度和效率方面的優越性。主要缺點是制備較困難、壽命較短、使用時易產生空泡。

2.3 毛細管等電聚焦電泳(Capillary isoelectric focusing，CIEF)

CIEF是一種基于等電點分離生物大分子的電泳技術。通過內壁涂層使電滲流減到最小，再將樣品和兩性電解質混合進樣，兩個電極槽中分別為酸和堿，加高電壓后，在毛細管內形成了pH值梯度。溶質遷移到相當于其等電點的位置時停止，由此產生一個非常窄的聚集區帶，不同等電點的溶質聚集在不同的位置上，形成一個個獨立的溶質區帶而彼此分開。該電泳技術分辨率較高，主要用于分離兩性化合物。

2.4 毛細管等速聚焦電泳(Capillary isotachophresis，CITP)

CITP是基于離子淌度分離帶電離子的技術，屬于不連續介質電泳。采用先導電解質充滿整個毛細管柱，淌度高于任何樣品組分；再將尾隨電解質置于一端的電泳槽中，淌度低于任何樣品組分。溶質按其電泳淌度不同得以分離。該電泳技術常用作柱前濃縮以富集樣品。

2.5 毛細管膠束電動色譜(Capillary micellar electrokinetic chromatography，MEKC)

MEKC是日本Terabe等在1984年提出在緩沖溶液中加入表面活性劑十二烷基磺酸鈉而建立的。其原理是當表面活性劑濃度超過臨界膠束濃度時，形成膠束。溶質按照其疏水性不同在水相和膠束相之間分配而得以分離。MEKC既能分離帶電物質又能分離中性物質，如引入手性添加劑環糊精及其衍生物形成的手性膠束，則可進行手性藥物的拆分分離[7]。

2.6 毛細管電色譜(Capillary electrochromatography，CEC)

CEC也稱填充柱毛細管電色譜，將HPLC中使用的眾多固定相填充到毛細管中或涂敷在毛細管壁上，毛細管兩端的高壓電相當于高壓泵，以電滲流作為驅動力，使樣品在兩相間進行分配得以分離。該電泳技術兼具了電泳和液相色譜的分離機制，提高了選擇性，雖然柱效較低、應用不多，僅在免疫學、藥物分析、富勒烯化學等領域有所研究，但卻是一種很有發展前景的電泳技術。

3 毛細管電泳技術在蛋白質生物制品分析中的應用

3.1 取代平板凝膠技術——CE-SDS

CE-SDS是一種高效、快速的分離分析蛋白質生物制品的方法，用于評估蛋白質生物制品的純度、特性和穩定性[8]。對于蛋白質生物制品來說，其大小異質性程度很高[9，10]，CE-SDS是評估蛋白質生物制品大小異質性的一種強有力方法。以重組人源化單克隆抗體(rhuMAbs)為例，其大小變異體包括：游離的輕/重鏈片段、蛋白質的斷裂片段[11]、不可分離的更高分子量的種類、二硫鍵異構體、糖基化位點相關的種類等。傳統電泳技術不能有效檢測抗體的異質性，而CE-SDS具備可任選擇的檢測靈敏度：UV檢測(考馬斯亮藍染色的靈敏度)、LIF檢測(銀染色的靈敏度)，能夠快速準確地檢測抗體大小異質性。另外，CE-SDS可以實現樣品制備自動化，大幅提高了樣品分析的效率和精確度。

最近有基于CE-SDS方法對治療性單克隆抗體(rMAb)成功進行分析的報道[12]。rMAb標準品是一個輕鏈(LC)、非糖基化重鏈(NGHC)和重鏈(HC)的混合物。CE-SDS較強的分離能力主要體現在對HC和NGHC兩者之間的分辨率，因為NGHC含量很低(<5%)，傳統方法很難準確檢測。采用CE-SDS分析這些組分相對遷移時間的相對標準偏差為2%，通過峰面積對這些組分進行定量，其相對標準偏差<9%。

大部分蛋白都存在糖基化修飾，用SDS凝膠電泳測定糖蛋白的分子量存在著困難，因為糖蛋白的寡糖鏈不結合SDS，引起荷質比降低，導致糖蛋白分子量測定不準確。Ferguson分析方法指出：在不同的凝膠濃度下對糖蛋白進行SDS-PAGE分析，可消除寡糖對糖蛋白分子量測定的影響，這種方法在CE-SDS中同樣適用[13]。

3.2 HPLC技術的輔助手段——CZE

CZE高效、快速、簡便的特點使其在蛋白質、多肽分離及純度鑒定方面應用日益普遍，尤其是生物技術和基因工程中大量生物合成的蛋白質、多肽能用CZE進行有效的分離分析，以確定產品的純度、均一性及生產過程的可靠性。目前，CZE在蛋白質和多肽分析中的用途主要包括：蛋白質、多肽的分離及純度鑒定；蛋白質、多肽的結構分析；監測蛋白質、多肽的反應過程及結構變化。另外，蛋白質生物制品電荷異質化程度高，CZE也是快速分析蛋白質生物制品電荷異質性的重要手段之一[14]。Ma[15]首次使用CZE分析治療性單克隆抗體(mAbs)的電荷異質性，使用涂層毛細管以消除蛋白質對毛細管的吸附，結果顯示：CZE能夠快速準確地分析mAbs的電荷異質性。He等[16]使用CZE成功實現了幾種mAbs及其電荷異質體的分離，并使用濃縮的兩性離子緩沖溶液以及酸性溶液來抑制電滲流和蛋白質吸附。

高效液相色譜法在分析蛋白質、多肽及核酸等生物大分子時，因樣品組分擴散系數小、傳質阻力大而導致分離效率較低。Aeberold設計了一種柱上電泳富集方法，使CZE適用于分析HPLC分離后濃度較低的肽段，并認為CZE是鑒定HPLC收集的毫克級以下肽段純度最有效的方法[17]。

應用CZE分離蛋白質、多肽具有其獨特的優越性，同時也存在峰容量小、難以大量制備的缺點，因此其并不能完全取代其它分析方法(如HPLC)，但至少是一項有效的補充手段。目前，CZE在生物大分子領域的分析還處于起步階段，隨著其研究和應用的深入，CZE有望在蛋白質、多肽等生物分子的實際分析中發揮更重要的作用。

3.3 碳水化合物分析——CE/CE-MS

由于寡糖鏈不但能參與細胞識別和分子識別，還參與糖蛋白的分揀(Sortins)和投送(Toffickins)、抗體依賴的細胞毒性[18]等細胞過程，并且在蛋白質合成過程中由于環境條件的改變寡糖表面很容易發生改變，因此表征蛋白質藥物上糖結構的分析方法非常重要，但由于寡糖鏈異質化程度高，糖基化分析具有極大的挑戰性。糖鏈表征的最常用技術包括HPLC、MS和CE，其中CE柱效高、分析速度快[19]，是分析蛋白質生物制品糖基化結構的重要手段，目前已在蛋白質生物制品質量控制中廣泛應用。CE主要用于蛋白質藥物表面的N-低聚糖、單糖的定量分析(暴露末端單糖殘基，即半乳糖和β-N-乙酰氨基葡萄糖)。Ma等[19]使用CE對利妥昔單抗(Rituximab)進行糖基化分析，結果顯示：此方法簡便、精確度和準確度高，可以用于大批量樣品日常檢測。

另外對于CE分析中小峰表征的難題，可以采用CE-MS，CE-MS不僅具有強大的分離能力，而且具有質譜的靈敏度。CE-LIF-MS技術已被成功地用于微量碳水化合物樣品的直接鑒定。Gennaro等[20]用在線CE-LIF-MS 分析了來自藥用單克隆抗體(mAb)中的碳水化合物，可對微量組分進行鑒定和定量。隨著CE與MS儀器的發展、接口技術的不斷完善，CE-MS技術必將成為生物制品碳水化合物分析強有力的工具，并促進生物制品分析領域的迅猛發展。

3.4 檢測蛋白質等電點——CIEF

每個蛋白質都有唯一的等電點(pI)和/或電泳曲線圖，用已知等電點的蛋白質作為標準進行電泳，以等電值作縱坐標、相對遷移值作橫坐標，繪制標準工作曲線，再得出未知物的相對遷移值，即可求其等電點。由于蛋白質、多肽的電荷異質性程度比較高，主要是由于部分糖基化、蛋白質骨架裂解、脫酰氨基作用引起，CIEF能夠準確檢測蛋白質、多肽的電荷異質性[21，22]，從而能夠準確計算出蛋白質、多肽樣品的純度。Ongay等[23]采用CIEF測定了來源于不同細胞的重組人源化VEGF165的pI值，并比較了昆蟲細胞和大腸桿菌表達的重組人源化VEGF165的pI值差異。

3.5 高通量的分離技術——微芯片毛細管電泳(MCE)

MCE是將CE移植到芯片上，將樣品進樣、反應、分離、檢測等過程集成到一起的多功能化的快速、高效、低耗微型技術。

MCE與CE相比有許多優點，如進樣量小、散熱性能好，因此允許使用較高的電場，可以大大加快分離速度，另外通過多通道設計及通道設計的任意性實現了芯片的高通量、集成化，目前已經在蛋白質分析中得到了廣泛的應用。如Rodriguez等[24]在微芯片上采用MCE高效分離了FITC標記的氨基酸對映異構體等。然而，MCE還處于起步階段，技術還不成熟，但其突出的優點與廣闊的應用前景，使MCE成了分析化學一個發展迅猛的領域。關鍵問題仍集中于微型化、集成化、高通量和接口設計等幾個方面[25，26]，其中芯片微通道的設計布局與芯片制作技術仍將是該領域研究的重點。

4 展望

作為一種高效分離分析方法，毛細管電泳在蛋白質生物制品分析領域顯示了獨特的優勢，并得到了廣泛的應用。隨著新型檢測器、新型分離材料、儀器微型化等方面的研究以及毛細管電泳技術與其它技術(如HPLC、MS等)的聯合應用的進一步深入，毛細管電泳在系統重現性、自動化程度以及檢測靈敏度方面都有了大幅提高，可以預言，毛細管電泳在未來生物制品分析領域中的前景會更加廣闊。其中，毛細管電色譜和微芯片毛細管電泳以其樣品微量性、分離效率高、速度快、費用低等優點將成為推動毛細管電泳技術邁向常規檢測技術的重要力量。

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