系統性硬皮病患者外周血單個核細胞對皮膚克隆成纖維細胞膠原代謝的影響

高地 朱鷺冰 李明

（復旦大學附屬中山醫院皮膚科，上海 200032）

系統性硬皮病（systemic scleroderma，SSc）是一種頑固的自身免疫性疾病，其免疫紊亂表現在多個方面。免疫活性細胞（主要是淋巴細胞）及其相關細胞因子和趨化因子在SSc發病機制中的作用逐漸引起關注［1］。我們的前期研究［2］顯示皮膚成纖維細胞外微環境中細胞因子異常可能參與SSc患者皮膚成纖維細胞高膠原合成克隆的形成。外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）以淋巴細胞為主，能產生多種細胞因子。本研究旨在探討SSc患者的PBMC對具有不同膠原合成能力的皮膚克隆成纖維細胞的膠原代謝的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 DMEM高糖培養基、胎牛血清由PAA公司生產；小鼠抗人波形蛋白、細胞角蛋白單抗由Abcam公司生產；兔抗人Ⅷ因子多抗由Antibody Diagnostica公司生產；親和素－生物素－酶復合物顯色試劑盒和生物素化馬抗小鼠、羊抗兔二抗由Vector公司生產；RNA提取試劑盒由Invitrogen公司生產和cDNA合成試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、引物和TaqMan探針由上海閃晶公司生產；淋巴細胞分離液、植物血凝素（phytohemaggtutinin，PHA）由Sigma公司生產。

1.2 研究方法

1.2.1 篩選SSc和健康皮膚具有不同膠原合成能力的異質性成纖維細胞克隆 選取5例病程＜3年且符合美國風濕病學會1980年分類標準［3］的進展期SSc患者（研究組）分別在局部麻醉下切取其前臂逐漸擴大的硬化皮損邊緣的皮膚組織；同時選取4例性別、年齡匹配的整形外科手術者（對照組），在局部麻醉下切取其相應部位的健康皮膚組織。所有研究對象均知情同意。

采用組織塊培養法原代培養成纖維細胞并傳代增殖，對第2代細胞進行免疫組織化學鑒定并采用改良有限稀釋法分離克隆。采用實時熒光定量逆轉錄－聚合酶鏈反應（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）法檢測克隆成纖維細胞內Ⅰ型前膠原的mRNA水平［4］。

1.2.2 PBMC的分離 無菌采集對照組和研究組病情活動期患者各3例的靜脈血5mL，加入盛有肝素的無菌小瓶，加蓋后輕輕搖勻。取抗凝血，計數白細胞總數后，采用密度梯度離心法分離PBMC，以Hanks液重懸細胞，洗滌2次后計數細胞。根據計數結果，將PBMC稀釋至106／mL（細胞懸液片含5μg／mL PHA），接種于25cm2培養瓶，置于37℃、5%CO2培養箱中培養48h。離心，收集上清液。

1.2.3 PBMC對SSc皮膚克隆成纖維細胞中Ⅰ型前膠原和基質金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase－1，MMP－1）mRNA水平的影響 根據預實驗，確定PBMC培養上清液的濃度為10%。在篩選出的SSc皮膚克隆成纖維細胞中，選取Ⅰ型前膠原mRNA高、低表達的克隆各3個，每個克隆經0.25%胰蛋白酶消化后，分別接種于4個3.5cm2培養皿，培養至80%融合時，棄生長培養液，換為含0.1%胎牛血清的DMEM高糖培養液培養24h，棄培養液，每個克隆提取其中1個培養皿細胞的總RNA，另外3個培養皿分為3組，分別為未干預組、研究組PBMC培養上清液干預組和對照組PBMC培養上清液干預組。按確定的PBMC培養上清液的終濃度（10%）配制含0.1%胎牛血清的DMEM高糖培養液，分別加入Ⅰ型前膠原mRNA高表達和低表達的SSc皮膚克隆成纖維細胞的細胞培養基中，培養48h后提取總RNA，與干預前提取的總RNA一起以實時熒光定量RT－PCR法檢測Ⅰ型前膠原和MMP－1mRNA水平。采用各樣品干預后與干預前目的基因mRNA的△CT的差△△CT表示干預因素的作用大小：△△CT絕對值大，表示干預因素作用大；反之，表示干預因素作用小；△△CT為正值，表示干預因素使目的基因mRNA的水平上升；△△CT為負值，表示干預因素使目的基因mRNA的水平下降。

1.3 統計學處理 采用SPSS 11.5軟件進行統計學分析。計數資料以均數±標準差（ˉx±s）表示。采用兩因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 篩選SSc和正常皮膚具有不同膠原合成能力的異質性成纖維細胞克隆 研究組和對照組分別獲得36個和32個皮膚成纖維細胞的克隆，其免疫組織化學結果顯示：胞漿波形蛋白陽性、角蛋白陰性、Ⅷ因子陰性，符合成纖維細胞的特征。由于克隆細胞體外生存期有限，不可能對所有克隆進行測定，因此在獲得的克隆中，檢測研究組5例共25個克隆和對照組4例共21個克隆。通過樣品聚類分析將Ⅰ型前膠原mRNA水平分為高表達（△CT＞1）、中表達（－1≤△CT≤1）和低表達（△CT＜－1），研究組高、低表達克隆數分別為12個和7個，對照組高、低表達克隆數分別為3個和5個。

2.2 PBMC對SSc皮膚克隆成纖維細胞Ⅰ型前膠原和MMP－1的mRNA水平的影響

2.2.1 PBMC對SSc皮膚克隆成纖維細胞中的Ⅰ型前膠原mRNA水平的影響 見表1。

2.2.2 PBMC對SSc皮膚克隆成纖維細胞中的MMP－1的mRNA水平的影響 見表2。

表1 PBMC對SSc患者Ⅰ型前膠原mRNA高和低表達皮膚克隆成纖維細胞Ⅰ型前膠原mRNA水平的影響（ˉx±s，△△CT）

表2 PBMC對SSc患者Ⅰ型前膠原mRNA高和低表達皮膚克隆成纖維細胞MMP－1mRNA水平的影響（ˉx±s，△△CT）

3 討 論

在SSc發病的早期，患者皮膚真皮下層存在以CD4＋T輔助細胞為主的淋巴細胞浸潤，提示免疫活性細胞可能通過直接或間接產生細胞因子／趨化因子來誘導產生或調節“硬皮病成纖維細胞表型”［5－6］。研究［7］顯示，SSc患者 PBMC 和皮膚 成纖維細胞共培養后，T淋巴細胞的寡克隆擴增與發生在皮膚的T淋巴細胞寡克隆擴增類似。

既往關于SSc患者PBMC培養上清與皮膚成纖維細胞共培養的研究均未考慮PBMC干預前成纖維細胞膠原合成能力對干預結果的影響，本研究以SSc皮膚克隆成纖維細胞作為研究對象，探討PBMC對SSc具有不同膠原合成能力的皮膚克隆成纖維細胞的膠原代謝的影響。

本研究結果表明，SSc具有不同膠原合成能力的克隆成纖維細胞中Ⅰ型前膠原、MMP－1mRNA水平對PBMC的反應存在異質性。SSc患者PBMC培養上清與皮膚克隆成纖維細胞共培養48h，僅使具有低膠原合成能力的SSc克隆成纖維細胞的Ⅰ型前膠原和MMP－1mRNA水平上升，未發現其對高表達者有影響。

［1］ Gu YS，Kong J，Cheema GS，et al.The immunobiology of systemic sclerosis［J］.Semin Arthritis Rheum，2008，38（2）：132－160.

［2］ 高地，朱鷺冰，李明.細胞因子TGFβ1，CTGF和IFN－γ對系統性硬皮病克隆成纖維細胞膠原代謝的影響［J］.中國皮膚性病學雜志，2012，26（1）：9－11.

［3］ Subcommittee for scleroderma criteria of the American rheumatism association diagnostic and therapeutic criteria committee.Preliminary criteria for the classification of systemic sclerosis（scleroderma）［J］.Arthritis Rheum，1980，23（5）：581－590.

［4］ 高地，朱鷺冰，李明.系統性硬皮病患者皮膚克隆成纖維細胞膠原代謝的異質性［J］.中國皮膚性病學雜志，2010，24（12）：1092－1095.

［5］ Sakkas LI，Platsoucas CD.Is systemic sclerosis an antigendriven T cell disease？［J］.Arthritis Rheum，2004，50（6）：1721－1733.

［6］ Abraham DJ，Eckes B，Rajkumar V，et al.New developments in fibroblast and myofibroblast biology：implications for fibrosis and scleroderma［J］.Curr Rheumatol Rep，2007，9（2）：136－143.

［7］ De Palma R，Del Galdo F，Lupoli S，et al.Peripheral T lymphocytes from patients with early systemic sclerosis co－cultured with autologous fibroblasts undergo an oligoclonal expansion similar to that occurring in the skin［J］.Clin Exp Immunol，2006，144（1）：169－176.