脂多糖刺激黏液下腺細(xì)胞后黏蛋白5AC和水通道蛋白5的變化

沈瑤 白春學(xué) 金美玲 陳智鴻

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，＊呼吸科，上海 200032）

氣道表面液體是機(jī)體抵御有害物質(zhì)的第一道屏障，機(jī)體可以通過(guò)纖毛運(yùn)動(dòng)清除氣道中的病原體和有毒物質(zhì)［1］。但是，持續(xù)過(guò)多的黏液會(huì)阻塞呼吸道管腔，導(dǎo)致氣流受限、氣道反復(fù)感染。黏蛋白（mucin，MUC）為氣道黏液的主要成分，已知人類(lèi)有20種不同的黏蛋白，MUC5AC和MUC5B為氣道分泌物的主要成分，其中 MUC5AC為可誘導(dǎo)性，而MUC5B則多為持續(xù)性表達(dá)。吸煙、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、大氣污染、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等均可刺激 MUC5AC的表達(dá)［2］。水份占?xì)獾鲤ひ嚎偭康?5%，水份減少將使黏蛋白／水鹽比例升高，凝膠層的黏液會(huì)下降，影響?zhàn)ひ海w毛的擺動(dòng)。水通道蛋白（aquaporin，AQP）主要參與滲透壓驅(qū)動(dòng)下水的轉(zhuǎn)運(yùn)。AQP1、AQP3、AQP4、AQP5為肺相關(guān)的水通道蛋白，其中AQP5位于肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞 （alveolar typeⅠcell，ATⅠ）的腔頂面和鼻咽和呼吸道黏膜下腺的上皮細(xì)胞腔頂［3］。小鼠屋塵螨致敏的慢性模型顯示AQP 5基因敲除鼠肺組織中MUC5AC較野生鼠降低［4］。應(yīng)用RNAi特異性抑制人肺腺癌細(xì)胞株SPC－A1中AQP5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MUC5AC表達(dá)進(jìn)行性升高［5］，提示AQP 5在黏液分泌中起著重要的作用。

本研究擬采用黏液下腺SPC－A1細(xì)胞株，觀(guān)察LPS刺激后AQP5和MUC5AC的變化。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) SPC－A1細(xì)胞株在含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和傳代。

1.2 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reation，PCR） 采用Rotor－Gene RG 3000儀進(jìn)行檢測(cè)。①β－actin－sense：5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′，antisense： 5′ ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′②AQP5－sense：5′CTGTCCATTGGCCTGTCTGTC3′，antisense：5′GGCTCATACGTGCCTTTGATG3′，③ MUC5AC－sense：5′GAGGGCAACAACGTCATCTCC 3′，antisense：5′TCT TGGTCAGCCACCTTCACA3′。

1.3 Western雜交 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）按常規(guī)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組間兩兩比較采用方差分析，組間比較采用Student－Newman－Keuls檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LPS刺激后AQP5mRNA和AQP5蛋白呈劑量依賴(lài)性降低 將 LPS 0μg／mL、5μg／mL、1 μg／mL、20μg／mL、40μg／mL加入SPC－A1細(xì)胞株中，24h檢測(cè)AQP5的蛋白和AQP5mRNA水平（圖1）。AQP5mRNA在LPS為10μg／mL時(shí)開(kāi)始下降，LPS 為 20μg／mL 時(shí)至低谷（P＜0.05）。Western雜交顯示AQP5的蛋白水平也隨LPS濃度的增加逐漸降低，LPS 10μg／mL時(shí)開(kāi)始下降，LPS為20μg／mL時(shí)減至低谷，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用20μg／mL的LPS濃度進(jìn)行。

圖1 LPS刺激SPC－A1細(xì)胞株后，AQP5mRNA和AQP5蛋白呈劑量依賴(lài)性降低

2.2 LPS刺激后AQP5呈時(shí)間依賴(lài)性降低 20 μg／mL濃度的LPS干預(yù)SPC－A1細(xì)胞株，0、12、24、48h后收集細(xì)胞，結(jié)果顯示LPS刺激6h后AQP5 mRNA（0.23±0.04）開(kāi)始下降，24h后達(dá)低谷，48 h為最低。LPS刺激6h后AQP5蛋白水平開(kāi)始下降，24h后達(dá)低谷，48h為最低（圖2）。

圖2 LPS刺激SPC－A1細(xì)胞株后，AQP5mRNA和AQP5蛋白呈時(shí)間依賴(lài)性降低

2.3 LPS刺激后 MUC5AC mRNA和 MUC5AC蛋白水平呈劑量依賴(lài)性增加 將0μg／mL、5μg／mL、10μg／mL、20μg／mL、40μg／mL濃度的 LPS加入SPC－A1細(xì)胞株中，培養(yǎng)24h后觀(guān)察不同濃度LPS刺激后MUC5AC mRNA和MUC5AC蛋白的變化。PCR顯示LPS濃度10μg／mL時(shí)MUC5AC mRNA水平開(kāi)始上升（1.3±0.14），LPS為40μg／mL時(shí)上升最多，再增加LPS濃度其并未繼續(xù)上升。ELISA檢測(cè)MUC5AC蛋白水平可見(jiàn)LPS 10μg／mL時(shí)MUC5AC蛋白水平開(kāi)始上升，LPS為40 μg／mL時(shí)上升最多，再增加LPS濃度并未繼續(xù)上升（圖3）。

圖3 LPS刺激SPC－A1細(xì)胞株后，MUC5AC mRNA和MUC5AC蛋白水平呈劑量依賴(lài)性升高

2.4 LPS刺激 MUC5AC mRNA和 MUC5AC蛋白水平呈時(shí)間依賴(lài)性增加 20μg／mL濃度的LPS刺激SPC－A1細(xì)胞株0、12、24、48h后收集細(xì)胞檢測(cè)MUC5AC mRNA和MUC5AC蛋白含量。PCR顯示刺激6h時(shí)，MUC5AC mRNA水平開(kāi)始上升，24h后達(dá)高峰。ELISA檢測(cè)MUC5AC蛋白水平，可見(jiàn)刺激6h后MUC5AC蛋白水平開(kāi)始上升，24h后達(dá)高峰（圖4）。

圖4 LPS刺激SPC－A1細(xì)胞株后，MUC5AC mRNA和MUC5AC蛋白水平呈時(shí)間依賴(lài)性增加

3 討 論

慢性阻塞性肺病急性發(fā)作期常和細(xì)菌感染有關(guān)。LPS為革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁，是細(xì)菌致病的主要成分。本研究顯示LPS刺激黏液下腺SPC－A1細(xì)胞株后，AQP5mRNA和AQP5蛋白水平呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性降低，同時(shí)MUC 5AC的mRNA及MUC5AC蛋白水平。呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性升高。黏蛋白雖然只占呼吸道黏液總量的2%，卻是黏液粘性和彈性的主要來(lái)源，它能吸附異物顆粒和病原微生物，隨纖毛擺動(dòng)將其排除體外。哮喘和慢性阻塞性肺病患者氣道黏液MUC5B／MUC5AC比例增高，且MUC2含量減少。說(shuō)明在不同疾病狀態(tài)下，呼吸道黏液譜及比例可能不同。很多因素如吸煙、中性粒細(xì)胞等均刺激上皮細(xì)胞MUC5AC的產(chǎn)生［2］。近期國(guó)內(nèi)有研究顯示，原代培養(yǎng)的兔氣道上皮，置于高滲液體中，AQP5下降，MUC5AC分泌上升。因此，LPS可以降低黏液下腺細(xì)胞中AQP5的表達(dá)，同時(shí)增加MUC5AC的表達(dá)，使黏蛋白比例失衡、黏液增多且黏稠不易咳出。

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