二氮嗪預(yù)處理對(duì)大鼠部分肝移植的保護(hù)作用

宋康 孫綺蠻 周儉 黃曉武 史穎弘 肖永勝 譚長(zhǎng)軍 高強(qiáng) 何義舟 成劍文 楊柳曉 樊嘉

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科，上海 200032）

部分肝移植已成為目前治療各類終末期肝病的有效手段，它的開(kāi)展使得當(dāng)前供肝缺乏的現(xiàn)狀得以緩解。然而，移植肝在手術(shù)過(guò)程中不可避免地經(jīng)歷了缺血再灌注，這是造成術(shù)后移植肝功能不良的重要因素。線粒體膜上存在對(duì)ATP濃度敏感的鉀離子通道－－mitoKATP （mitochondrial ATP－sensitive potassium channels），其活性不僅可以被ATP抑制，也可以被 5－羥基癸酸鹽 （5－h(huán)ydroxydecanoate sodium salt，5－HD）和磺脲類藥物特異性關(guān)閉［1］，而二氮嗪（diazoxide，DA）則能特異性開(kāi)放該通道［2］。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)mitoKATP對(duì)肝臟的缺血再灌注損傷影響的研究很少。本研究在大鼠60%比例部分肝移植術(shù)前采用DA預(yù)處理供體，觀察DA對(duì)大鼠部分肝移植中缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的清潔級(jí)雄性SD（Sprague－Dawley）近交系大鼠，體質(zhì)量220～300g，分籠飼養(yǎng)，予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。將150只大鼠隨機(jī)配成75對(duì)，并分為3組：對(duì)照組（C組）、DA預(yù)處理組（DA組）、5－HD＋DA預(yù)處理組（HD－DA組），每組25對(duì)。每對(duì)大鼠中，供體體質(zhì)量應(yīng)比受體輕10～20g。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)術(shù)前準(zhǔn)備 供、受體術(shù)前均禁食12 h，自由飲水。受體術(shù)前30min肌注阿托品0.03 mg。術(shù)前將大鼠置于充滿乙醚氣體的封閉容器中3～5min麻醉，術(shù)中乙醚持續(xù)開(kāi)放麻醉。供、受體手術(shù)均由2名醫(yī)師完成操作。C組術(shù)前供體不進(jìn)行藥物預(yù)處理；DA組供體在術(shù)前30min腹腔注射DA（5mg／kg）；HD－DA組供體在術(shù)前45min腹腔注射5－HD（5mg／kg），15min后腹腔注射 DA（5 mg／kg）。

1.3 供體手術(shù) 從陰莖背靜脈注入含肝素的0.9%氯化鈉液2mL（肝素濃度：50U／mL），取腹部大“十”字切口進(jìn)腹。剪開(kāi)肝鐮狀韌帶，確認(rèn)肝上下腔靜脈無(wú)變異后，用0.9%氯化鈉液浸濕的紗布覆蓋腸管并推向左側(cè)腹部。游離肝下下腔靜脈，將右腎靜脈與右腎動(dòng)脈分離，分別結(jié)扎右腎靜脈和右腎上腺靜脈。插入膽道插管至左、右肝管會(huì)合部稍下方，結(jié)扎固定。游離尾狀葉，于根部結(jié)扎后將其切除。結(jié)扎肝食管交通支，縫扎左隔下靜脈。縫扎并結(jié)扎左外葉根部后切除左外葉。游離腹主動(dòng)脈，向近心端穿刺輸液針，迅速剪開(kāi)右側(cè)部分膈肌，阻斷胸主動(dòng)脈，于右心耳水平剪斷肝上下腔靜脈，于左腎靜脈水平剪斷肝下下腔靜脈，建立流出道；用0～4℃乳酸林格氏液（含肝素25U／mL）以2.5mL／min的速度持續(xù)重力灌注，灌注高度50cm。待肝臟灌注充分，呈均勻黃白色后，分離肝周韌帶。解剖門(mén)靜脈，分離、切斷肝動(dòng)脈，結(jié)扎并切斷胃冠狀靜脈、脾靜脈，在距脾靜脈下2mm處切斷門(mén)靜脈，隨后停止灌注。迅速切斷肝后韌帶和肝上下腔靜脈膈肌環(huán)，取出肝臟置于器官修整皿中，在0～4℃乳酸林格氏液中保存。

1.4 供肝修整 剔除肝下下腔靜脈以及門(mén)靜脈周?chē)慕Y(jié)締組織和脂肪組織，分別套管。剪開(kāi)膈肌環(huán)膜，沿膈肌環(huán)剪除膈肌，在肝上下腔靜脈左右兩側(cè)角分別預(yù)置7－0縫線。

1.5 受體手術(shù) 采用正中切口進(jìn)腹，剪開(kāi)肝鐮狀韌帶，確認(rèn)肝上下腔靜脈無(wú)變異后，用0.9%氯化鈉液浸濕的紗布將腸管推向左下腹部。縫扎左隔下靜脈，結(jié)扎肝食管交通支。游離肝下下腔靜脈至右腎靜脈，結(jié)扎右腎上腺靜脈。分離肝周組織、肝后韌帶至膈肌環(huán)，游離肝上下腔靜脈。于第一肝門(mén)分離膽總管，在左右肝管分叉水平結(jié)扎并切斷膽總管。縫扎并切斷肝動(dòng)脈。分離門(mén)靜脈至左右支分叉處。用無(wú)創(chuàng)血管夾分別于右腎靜脈上方和胃冠狀靜脈上方阻斷肝下下腔靜脈和門(mén)靜脈，然后停止吸入乙醚。于門(mén)靜脈左右支分叉處穿刺，快速注入常溫乳酸林格氏液約2mL，以排盡肝內(nèi)血液。分別縫扎門(mén)靜脈左、右支，保留縫線用無(wú)創(chuàng)血管鉗兩側(cè)牽引。用Satinsky鉗阻斷肝上下腔靜脈，貼近肝臟剪斷肝上下腔靜脈。于門(mén)靜脈左右支結(jié)扎線肝側(cè)剪斷門(mén)靜脈。剪斷肝下下腔靜脈，移除受體肝臟。將供肝原位放入腹腔，在供肝表面覆蓋含0～4℃保存液的濕棉片予以低溫保護(hù)。在供肝肝上下腔靜脈兩側(cè)角的預(yù)置縫線與受體相應(yīng)位置縫合打結(jié)，連續(xù)縫合后壁和前壁。用含肝素的0.9%氯化鈉液分別沖洗受體和供肝門(mén)靜脈腔。將供肝門(mén)靜脈套管套入受體門(mén)靜脈內(nèi)，結(jié)扎固定于套管刻槽內(nèi)。移除無(wú)創(chuàng)血管夾，開(kāi)放門(mén)靜脈血流，肝臟迅速恢復(fù)血供，呈暗紅色。待肝下下腔靜脈有血液流出時(shí)，用無(wú)創(chuàng)血管夾阻斷肝下腔靜脈，并移除阻斷受體肝上下腔靜脈的Satinsky鉗。同門(mén)靜脈吻合的方法，將供肝下腔靜脈套管套入受體肝下下腔靜脈內(nèi)，結(jié)扎固定于套管刻槽內(nèi)。將供肝膽道支架管插入受體膽總管，結(jié)扎并固定。用無(wú)菌棉球擦凈腹腔積液，分層間斷縫合切口。

1.6 術(shù)后處理 術(shù)后大鼠活動(dòng)自如時(shí)，將其移入單籠飼養(yǎng)。手術(shù)當(dāng)天禁食，術(shù)后自由飲水，第2天起予標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)食。均未予以補(bǔ)液及抗生素、免疫抑制劑治療。

1.7 標(biāo)本采集 于術(shù)后2h、1d、3d、5d和7d，將每組大鼠各處死5只并在無(wú)菌條件下取材。在血供未斷的條件下，用預(yù)冷的鋒利剪刀快速剪下一小塊肝組織，將其浸泡在0～4℃的2.5%戊二醛溶液中；用預(yù)冷的刀片修整剪切的斷面，把組織切成一薄片，再切成7～8個(gè)小塊，大小約1mm3；用棉簽迅速將其轉(zhuǎn)移到盛有預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液的標(biāo)本瓶中，置于冰箱4℃保存。經(jīng)腹主動(dòng)脈穿刺緩慢勻速抽血，采血5～10mL，4℃離心（3000r／min，20 min）后取上清，放入－80℃冰箱保存。取血后，切取約1cm3大小的肝組織，將其浸入10%甲醛溶液中固定，24h后放入30%乙醇中固定，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片。

1.8 檢測(cè)指標(biāo) 在光鏡下進(jìn)行HE染色病理檢查，在透射電鏡下進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)檢查，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）描述，組間數(shù)據(jù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡檢查 DA組移植術(shù)后肝細(xì)胞的腫脹變性壞死及空泡樣變性、肝小葉結(jié)構(gòu)排列的紊亂和匯管區(qū)的炎癥顯著輕于C組，而HD－DA組術(shù)后的肝損傷情況與C組相仿。

2.2 電鏡檢查 術(shù)后C組和HD－DA組可見(jiàn)細(xì)胞間隙明顯增寬，竇間隙顯著擴(kuò)張，線粒體腫脹明顯，線粒體嵴減少或消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張并有包裹線粒體現(xiàn)象，微絨毛喪失，Kupffer細(xì)胞侵入肝實(shí)質(zhì)，吞噬活躍，局部見(jiàn)壞死區(qū)；而DA組的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，線粒體腫脹及細(xì)胞間隙擴(kuò)張程度較輕，肝竇無(wú)擴(kuò)張，Kupffer細(xì)胞活躍度低，吞噬體不多見(jiàn)。見(jiàn)圖1和圖2。2.3 肝功能指標(biāo)測(cè)定 3組的ALT和AST值均在術(shù)后1d達(dá)到峰值，隨后逐步下降，至術(shù)后7d達(dá)到最低值。見(jiàn)表1和表2。

表1 各組術(shù)后ALT（U／L）比較

表2 各組術(shù)后AST（U／L）比較

3 討 論

組織的缺血再灌注損傷與線粒體能量轉(zhuǎn)換障礙、氧自由基產(chǎn)生增加、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞因子等炎性介質(zhì)的異常釋放等有關(guān)［3］。DA預(yù)處理可以對(duì)缺血再灌注損傷起保護(hù)作用，是由于位于線粒體膜上的mitoKATP通道對(duì)DA的敏感性幾乎是位于細(xì)胞膜上的KATP通道對(duì)DA的敏感性的2 000倍［4］。

本研究對(duì)大鼠進(jìn)行60%比例部分肝移植術(shù)后，病理檢查結(jié)果顯示C組和HD－DA組均出現(xiàn)嚴(yán)重的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、肝細(xì)胞的空泡樣變性和壞死以及大量的炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)；電鏡觀察也發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性被破壞、細(xì)胞間隙增寬、竇間隙顯著擴(kuò)張，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張、線粒體嵴減少消失及空泡樣變，微絨毛喪失，淋巴細(xì)胞侵入肝實(shí)質(zhì)，局部見(jiàn)壞死區(qū)、巨噬細(xì)胞吞噬活躍以及凋亡。DA組肝細(xì)胞及其細(xì)胞器的損傷程度顯著輕于其他2組。ALT和AST均在術(shù)后1d達(dá)到高峰，隨后逐步下降。DA組術(shù)后2h—3d的ALT和AST均顯著低于C組和HD－DA組 （P＜0.05）。本研究結(jié)果表明DA預(yù)處理可以改善部分肝移植術(shù)后的缺血再灌注損傷，但DA的保護(hù)作用可以被5－HD阻斷。

由于移植肝的缺血再灌注損傷是一個(gè)非常復(fù)雜的病理生理過(guò)程，涉及多種細(xì)胞、細(xì)胞因子間的互相作用及調(diào)控，DA預(yù)處理改善缺血再灌注損傷的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

［1］ Hu H，Sato T，Seharaseyon J，et al.Pharmacological and histochemical distinctions between molecularly defined sarcolemmal KATP channels and native cardiac mitochondrial KATP channels［J］.Mol Pharmacol，1999，55（6）：1000－1005.

［2］ Inoue I，Nagase H，Kishi K，et al.ATP－sensitive K＋channel in the mitochondrial inner membrane［J］.Nature，1991，352（6332）：244－247.

［3］ Shinoda M，Shimazu M，Wakabayashi G，et al.Tumor necrosis factor suppression and microcirculatory disturbance amelioration in ischemia／reperfusion injury of rat liver after ischemic preconditioning［J］.J Gastroenterol Hepatol，2002，17（11）：1211－1219.

［4］ Garlid KD，Paucek P，Yarov－Yarovoy V，et al.Cardioprotective effect of diazoxide and its interaction with mitochondrial ATP－sensitive K＋ channels.Possible mechanism of cardioprotection［J］.Circ Res，1997，81（6）：1072－1082.