結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)進(jìn)展

楊淑華 綜述，張?jiān)孪?審校

(天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津300100)

結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的結(jié)核病是常見的人類傳染病之一。約三分之一的世界人口曾經(jīng)感染MTB，亞洲地區(qū)感染者占全世界的三分之二。據(jù)WHO估計(jì)，2007年全球約有927萬新發(fā)結(jié)核患者，175萬人死于結(jié)核病，中國是全球22個(gè)結(jié)核病高發(fā)國之一，發(fā)病人數(shù) 130萬，居世界第2位，僅次于印度[1，2]。結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，是確定結(jié)核病診斷和化療方案的重要依據(jù)，長(zhǎng)期以來，結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依賴細(xì)菌學(xué)涂片和培養(yǎng)檢查。由于方法所限，嚴(yán)重影響了結(jié)核病的及時(shí)診斷，因此建立檢測(cè)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的診斷方法，對(duì)于結(jié)核病防治工作具有重要意義[3]。現(xiàn)將近年來結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展綜述如下。

1 結(jié)核病病原菌檢測(cè)技術(shù)

1.1 抗酸桿菌涂片鏡檢

1.1.1 萋-尼氏抗酸染色涂片 萋-尼抗酸染色涂片鏡檢是經(jīng)典的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法，目前很多實(shí)驗(yàn)室仍然依靠此方法進(jìn)行結(jié)核檢測(cè)，但其靈敏度較低，僅20%～30%，而且此方法繁瑣，假陽性和假陰性較高。張立群對(duì)比了4種不同結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法，顯示萋-尼抗酸染色涂片的陽性率為11.6%，靈敏度僅為26.3%[4]。

1.1.2 熒光染色法 以金胺-羅丹明為代表的熒光染色法提高了鏡檢的靈敏度，并使讀片時(shí)間大大縮短，假陽性和假陰性也明顯降低[5]。但熒光顯微鏡昂貴的價(jià)格，限制了其在基層的應(yīng)用。

1.1.3 LED顯微鏡 將顯微鏡與發(fā)光二極管相結(jié)合研發(fā)的LED顯微鏡，具有低價(jià)格，長(zhǎng)壽命，強(qiáng)可靠性等優(yōu)點(diǎn)，診斷性能優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡。多項(xiàng)研究顯示：LED檢查的敏感性比傳統(tǒng)鏡檢方法高約10%[6]。同時(shí)具備熒光染色的優(yōu)點(diǎn)，且花費(fèi)低、可實(shí)施性強(qiáng)，可更廣泛地常規(guī)使用。

1.2 分枝桿菌培養(yǎng)技術(shù)

1.2.1 傳統(tǒng)結(jié)核菌培養(yǎng) 結(jié)核菌培養(yǎng)仍是目前診斷MTB的金標(biāo)準(zhǔn)，尤其是藥敏試驗(yàn)結(jié)果在指導(dǎo)臨床用藥及耐藥性檢測(cè)等方面具有重要作用[7]，是鑒定是否為活菌的可靠方法，但傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)需要4～6周才能檢測(cè)到結(jié)核菌的生長(zhǎng)，而且陽性率也只有30%～40%；特異性差，各種分枝桿菌均可生長(zhǎng)，要確定是否為結(jié)核菌，需結(jié)合分枝桿菌菌種鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)。

1.2.2 結(jié)核菌快速檢測(cè)系統(tǒng) BD公司推出的BACTEC-MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)/鑒定/藥敏系統(tǒng)，操作簡(jiǎn)便，陽性標(biāo)本檢出時(shí)間平均為9d；鑒定、藥敏試驗(yàn)時(shí)間平均為4d；陽性標(biāo)本檢出率比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法提高10.77%，比BACTEC-460法提高4.97%。

1.2.3 液體變色培養(yǎng)基測(cè)定法 此方法具有培養(yǎng)和藥物敏感性檢測(cè)的雙重功能。其原理是應(yīng)用含有氧化還原顯示劑無色四氮唑鹽的液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)有分枝桿菌生長(zhǎng)時(shí)，氧化還原系統(tǒng)將培養(yǎng)基中的無色四氮唑鹽還原成不溶于水的紫紅色物質(zhì)，并以顆粒形式分泌至細(xì)胞表面，從而使結(jié)核分枝桿菌菌落變成肉眼可觀察到的紅色或紫色菌落。本法陽性結(jié)果報(bào)告時(shí)間平均為10d左右，與LJ培養(yǎng)基比較提高陽性率約為10%～15%，且操作簡(jiǎn)便，不需要昂貴大型儀器設(shè)備，適于在發(fā)展中國家和貧困地區(qū)推廣應(yīng)用[8]。存在的問題是陽性率不高，結(jié)果判斷易帶主觀性，且變色存留時(shí)間較短，僅2～3d紫色即消失，需及時(shí)觀察結(jié)果[9]。

1.2.4 噬菌體裂解試驗(yàn) 檢測(cè)原理是分枝桿菌噬菌體可進(jìn)入活的分枝桿菌使其感染，隨后加入殺毒劑滅活未進(jìn)入感染菌體內(nèi)的噬菌體。進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體在感染菌體內(nèi)大量增殖，并裂解菌體，釋放出的子代噬菌體可感染并裂解隨后加入的指示細(xì)胞，從而在瓊脂平板上出現(xiàn)透亮的噬菌斑。因此，只要根據(jù)噬菌斑的有無及其多少就可判斷待檢標(biāo)本中是否存在活的MTB。由于噬菌體及敏感細(xì)胞均能快速增殖，本法從標(biāo)本采集處理到結(jié)果判定只需18～24h，并具有較高的敏感性和特異性，診斷肺結(jié)核的總敏感度75.0%，特異度為95.2%，陽性檢出率為75.0%，該方法敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，對(duì)結(jié)核病臨床診斷有較高的應(yīng)用價(jià)值[10]。但其測(cè)定結(jié)果可受許多測(cè)定因素的影響，如噬菌體濃度、結(jié)核分枝桿菌活性的保持、指示細(xì)胞的配置以及殺毒劑滅活時(shí)間等[11]。

2 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

2.1 結(jié)核菌素試驗(yàn) 包括舊結(jié)核菌素 (old tuber culin，OT)試驗(yàn)和結(jié)核菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)試驗(yàn)。優(yōu)點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)便、低成本，但假陽性率高，標(biāo)準(zhǔn)化難，且難以與卡介苗接種引起的免疫反應(yīng)相鑒別。

2.2 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù) 從20世紀(jì)70年代建立了酶聯(lián)免疫吸附法后，形成了很多以檢測(cè)結(jié)核抗體或結(jié)核抗原為主的免疫血清學(xué)檢測(cè)方法，在現(xiàn)代結(jié)核病的快速診斷中發(fā)揮著重要作用。

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

2.2.1.1 結(jié)核抗體測(cè)定 主要應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)結(jié)核病人血清中的特異性抗體。然而結(jié)核病患者經(jīng)常因免疫應(yīng)答低下，導(dǎo)致體液免疫檢測(cè)或細(xì)胞免疫檢測(cè)假陰性。且由于種屬間共同抗原決定簇的存在，導(dǎo)致結(jié)核抗原檢測(cè)的特異性和敏感性低下，致使此法難以取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。

2.2.1.2 結(jié)核抗原測(cè)定 檢測(cè)結(jié)核病患者血清結(jié)核桿菌抗原可以作為結(jié)核桿菌存在的直接證據(jù),也可以避免結(jié)核病患者因免疫應(yīng)答低下導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。近年來由于單克隆抗體制備技術(shù)的提高，可以制備高效價(jià)的特異性抗體，從而使得檢測(cè)結(jié)核病患者血清中的結(jié)核桿菌抗原成為結(jié)核診斷的新方法。張周云等[12]利用基因工程方法在體外表達(dá)結(jié)核分枝桿菌的 desA蛋白抗原制備成單克隆抗體，利用該抗體采用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)了139例臨床已確診的活動(dòng)性肺結(jié)核患者血清中結(jié)核抗原，結(jié)果表明，其敏感性為 84.17%特異性為92.19%。

2.2.2 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELI Spot)技術(shù)是檢測(cè)結(jié)核抗原致敏的特異性效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。本法可區(qū)分結(jié)核感染者和接種BCG的健康人群。優(yōu)點(diǎn)是靈敏、特異、快速，12h獲得結(jié)果，有利于結(jié)核感染者和活動(dòng)性結(jié)核病人的早期診斷，將成為基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)研究的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)[13]。缺點(diǎn)是操作較復(fù)雜，需特殊儀器設(shè)備，試劑費(fèi)用較貴。

2.2.3 斑點(diǎn)免疫金滲濾試驗(yàn) (DIGFA)該法比ELISA更為簡(jiǎn)便、快速，全程只需3～5min，并可單人份測(cè)定，由于操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)迅速，檢出率高，不需要貴重儀器設(shè)備，能快速測(cè)定抗結(jié)核抗體，是一種較為理想的臨床結(jié)核病輔助診斷方法[14]，因此深受歡迎。

2.2.4 免疫印跡技術(shù)(Western blot)結(jié)核抗體免疫印跡法檢測(cè)試劑盒選取的抗原來自于結(jié)核分枝桿菌全菌，并篩選出最具免疫原性及特異性高的蛋白成份做為診斷抗原，具有很高的敏感性和特異性，用于檢測(cè)痰菌陽性結(jié)核患者、痰菌陰性結(jié)核患者、肺外結(jié)核病的敏感性分別為93%、86%、89%，特異性超過95%。由于大幅度提高了診斷準(zhǔn)確性，可做為結(jié)核病診斷的確證實(shí)驗(yàn)。但該法較上述幾種測(cè)定方法繁瑣，臨床常規(guī)檢測(cè)應(yīng)用相對(duì)較少，主要廣泛用于科研實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞因子檢測(cè) 結(jié)核分枝桿菌感染人體后，刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞因子，其中最主要的是T細(xì)胞亞群、IFN-γ、IL-2及SIL-2R。通過檢測(cè)細(xì)胞因子水平可對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染及結(jié)核病的診斷提供參考。目前這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用也極為廣泛[15-17]。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

近年來核酸擴(kuò)增技術(shù)和雜交分析技術(shù)的發(fā)展，為分枝桿菌的檢測(cè)、鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)提供了極大的方便，可將診斷時(shí)間從幾周降低到幾天。研究、應(yīng)用報(bào)道較多的結(jié)核病基因診斷技術(shù)主要包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸探針雜交、DNA 序列測(cè)定、基因芯片、基因分型等。

3.1 核酸檢測(cè)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、核酸探針技術(shù)(DNA probe) 、DNA指紋技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)的特點(diǎn)是檢測(cè)敏感性高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速，在靈敏性上顯著優(yōu)于培養(yǎng)法和涂片法等傳統(tǒng)方法，可以反映結(jié)核菌的真實(shí)感染情況，對(duì)于臨床診斷和療效考察有一定的指導(dǎo)意義[18]。但因需要專門的儀器設(shè)備和復(fù)雜的技術(shù)支撐，在應(yīng)用范圍上受到了極大限制[19-21]。

3.2 基因芯片技術(shù) 基因芯片始創(chuàng)于90年代初，又稱DNA芯片，是分子生物學(xué)前沿的高新技術(shù)。其原理是在支持物(玻璃、硅片等)上將探針分子固定，然后與待檢標(biāo)本進(jìn)行分子雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)度從而得出樣品分子的數(shù)量和序列信息。此方法可一次性對(duì)樣品大量序列進(jìn)行檢測(cè)和分析，具有自動(dòng)化程度高，操作序列數(shù)量多，檢測(cè)效率高等優(yōu)點(diǎn)，可用于MTB菌種的鑒定、耐藥性的監(jiān)測(cè)、基因組比較分析等方面的研究。黃明翔等[22]應(yīng)用DNA芯片技術(shù)對(duì)分枝桿菌陽性培養(yǎng)物進(jìn)行菌種鑒定，并以傳統(tǒng)分枝桿菌菌種鑒定方法為對(duì)照，結(jié)果兩種方法鑒定吻合率為83.6%(112/134)，提示DNA芯片檢測(cè)技術(shù)可以簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異地進(jìn)行分枝桿菌的鑒定，但有待進(jìn)一步完善。

3.3 蛋白芯片技術(shù) 此技術(shù)是一高特異性、高通量、高靈敏度且微型化的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，是蛋白組學(xué)研究近年來新興起的一種方法。其原理是以微孔濾膜作為載體，將純化的結(jié)核菌脂阿拉伯甘露糖(LAM)、蛋白相對(duì)分子質(zhì)量16×103(rTPA16)和38×103(rTPA38)等3種抗原利用微陣列技術(shù)固相于同一膜片上，并利用微孔濾膜的滲濾、濃縮凝集作用，在固相膜上快速進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)，最后在膜上以免疫金作為標(biāo)記物直接顯色。顯色后將芯片放入芯片閱讀儀，用專門軟件對(duì)不同抗原點(diǎn)陣的灰度值進(jìn)行分析，整個(gè)過程不超過30 min。本法診斷結(jié)核病的特異性96.3%，靈敏度為72.0%[23]。其與酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)相比，特異性高、敏感性相當(dāng)。且金標(biāo)記物比酶穩(wěn)定，凍干后可在室溫下保存，優(yōu)于ELISA法。因此，可用于結(jié)核病的快速診斷，特別是肺外結(jié)核及菌陰肺結(jié)核病的快速診斷，該技術(shù)為臨床診斷結(jié)核病起到了積極的作用[24]。

綜上所述，由于痰涂片陽性率較低，鏡檢需要經(jīng)驗(yàn)，難以區(qū)分環(huán)境分枝桿菌造成的假陽性；痰培養(yǎng)需時(shí)太長(zhǎng)，滯后于臨床診斷和治療，因此細(xì)菌學(xué)檢查對(duì)結(jié)核病的診斷價(jià)值有限。血清免疫學(xué)檢測(cè)目前主要做結(jié)核抗體檢測(cè)，由于結(jié)核桿菌的抗原性和特異性差，結(jié)果也往往不太理想。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，用高度敏感的方法檢測(cè)結(jié)核菌及其特異性DNA片段，如PCR、生物探針和基因芯片等，需要相應(yīng)的檢測(cè)設(shè)備和檢測(cè)費(fèi)用高等未能廣泛推廣。因此，臨床實(shí)驗(yàn)室必須從菌體水平到分子水平，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法到現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)行全方位的研究和探索，才能適應(yīng)結(jié)核病臨床診斷和治療的需要，為結(jié)核病的有效控制提供理想的檢測(cè)手段。

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