豬瘟和藍耳病疫苗中BVDV和PCV污染情況調查

葉兆美

（四川鐵騎力士實業(yè)有限公司馮光德實驗室，四川 綿陽 621000）

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）與豬瘟病毒（CSFV）均屬黃病毒科、瘟病毒屬成員。豬瘟細胞苗在生產(chǎn)過程中要用牛血清、胰酶、牛睪丸等材料，這些材料中若帶有低滴度的BVDV病原，會造成豬瘟細胞苗的污染。另外，使用含BVDV抗體的牛血清也會干擾豬瘟病毒的體外培養(yǎng)。更為嚴重的是，豬使用污染的豬瘟疫苗后可感染BVDV，出現(xiàn)類似于豬瘟的臨床癥狀和病理變化。王新平等從我國疑似豬瘟病料中檢出了BVDV。BVDV株與CSFV株的核苷酸同源性約60%，氨基酸同源性約85%，在血清學上存在交叉反應，因而血清學方法難以區(qū)分。近年來，豬瘟細胞苗質量不穩(wěn)定，如滴度偏低，收次減少等，是否與細胞帶有低滴度的BVDV有關。豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）是首次作為一種PK15傳代細胞的污染物被發(fā)現(xiàn)的，血清學調查發(fā)現(xiàn)PCV1普遍存在于豬體內，但是目前還沒有發(fā)現(xiàn)一種疾病與PCV1有關。PCV2可以導致豬群發(fā)病，PCV2可以在PK15、Vero等細胞中生長，但是不出現(xiàn)細胞病變。PCV2感染已成為全球性豬流行病，它對全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。為什么在上世紀90年代突然暴發(fā)流行，此問題已成為世界豬病的焦點，而PCV2在細胞中可以生長但又不出現(xiàn)細胞病變的特點，使得有人懷疑用來培養(yǎng)疫苗病毒的細胞或種毒本身就受到了PCV2的污染。帶著這些疑問，筆者對目前市售的豬瘟疫苗和藍耳病活疫苗進行了BVDV和PCV2檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 市售4種豬瘟活疫苗，共計10個批次；市售4種豬藍耳病活疫苗，共計9個批次。

1.1.2 牛病毒性腹瀉病毒RT-PCR檢測試劑盒和豬圓環(huán)病毒聚合酶鏈反應PCR檢測試劑盒，均購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司；Marker購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牛病毒性腹瀉病毒PCR檢測方法 按應蓓蓓等（1999）介紹的方法，取凍干豬瘟活疫苗或藍耳病活疫苗0.02g，加入裂解液，按照說明書提取RNA，進行DNA擴增，電泳。BVDV目的條帶的擴增長度為341bp。

1.2.2 豬圓環(huán)病毒的PCR檢測方法 按應蓓蓓等（1999）介紹的方法，取稀釋備用的豬瘟活疫苗和藍耳病活疫苗各100μL，加入裂解液，按照說明書提取RNA，進行DNA擴增，電泳。PCV2目的條帶的擴增長度為1154bp，PCV1目的條帶的擴增長度為652bp。

2 結果

2.1 牛病毒性腹瀉病毒的PCR檢測結果 用PCR方法檢測的10份豬瘟活疫苗樣品和9份藍耳病活疫苗樣品中，有2份樣品為BVDV陽性，BVDV污染率為2/19=10.53%。其中，10份豬瘟疫苗中有1份樣品為BVDV陽性，此樣品為豬瘟脾淋苗；9份藍耳病疫苗中有1份樣品為BVDV陽性。

2.2 豬圓環(huán)病毒2型的PCR檢測結果 用PCR方法檢測的10份豬瘟活疫苗和9份藍耳病活疫苗樣品中，PCV2的污染率為2/19=10.53%。其中，10份豬瘟疫苗中有1份樣品為PCV2陽性，與BVDV陽性樣品為同一份樣品；9份藍耳病疫苗中有1份樣品為PCV2陽性，此樣品為高效細胞苗。

2.3 豬圓環(huán)病毒1型的PCR檢測結果 用PCR方法檢測的10份豬瘟活疫苗和9份藍耳病活疫苗樣品中，均未檢出PCV1。

3 討論與分析

3.1 目前，疫苗污染問題較嚴重，使用無BVDV污染并且無BVDV抗體的牛只供應的睪丸細胞，是生產(chǎn)豬瘟細胞疫苗的關鍵。中國獸藥監(jiān)察所2009年的檢測報告顯示，在23批次豬瘟牛睪丸細胞疫苗中發(fā)現(xiàn)有5批疫苗受牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）污染，污染率為21.74%。長期以來，臨床上所用的豬瘟疫苗主要由豬瘟兔化弱毒株通過牛睪丸細胞增殖培養(yǎng)而成。2010年據(jù)中國農(nóng)大黃凱等報道，對30個規(guī)模牛場進行BVDV抗體抽檢，其陽性率高達80%以上，表明我國牛群中普遍存在BVDV感染和流行。由于牛病毒性腹瀉病毒與豬瘟病毒同屬黃病毒科瘟病毒屬，同源性很高，因而能互相誘導同源病毒抗體。若將已感染牛病毒性腹瀉病毒或存在相應抗體的牛睪丸細胞用于疫苗制備，會由于BVDV在體外細胞培養(yǎng)中大多不產(chǎn)生細胞病變而在疫苗生產(chǎn)中難以檢測出來，從而極易造成受污疫苗出廠。在細胞培養(yǎng)中，所用犢牛血清若含有牛病毒性腹瀉病毒或相應抗體，則常規(guī)熱滅活方法仍不能保證完全殺滅犢牛血清中的BVDV，因此同樣容易導致疫苗受污染。

3.2 豬瘟抗體一直很高，為什么還會暴發(fā)豬瘟？BVDV感染妊娠母豬后可引起母豬繁殖障礙,誘發(fā)母豬流產(chǎn),產(chǎn)死胎和弱仔；還可以通過胎盤將病毒傳給胎兒，使其產(chǎn)下的仔豬發(fā)生先天性感染；BVDV也可引發(fā)2～4周齡的仔豬發(fā)病，臨床上表現(xiàn)為貧血，被毛粗亂，吃料少，消瘦，生長緩慢，結膜炎、關節(jié)炎，腹瀉，多數(shù)仔豬發(fā)生死亡，少數(shù)成為僵豬。剖檢可見心外膜、腎臟及淋巴結有多量出血點，胃、結腸、盲腸黏膜潰瘍,有多量扣狀腫，與慢性豬瘟在臨床癥狀和病理變化方面十分相似，鑒別與檢測都非常困難。BVDV感染豬只后，對豬瘟疫苗的免疫有干擾作用，能抑制豬瘟抗體的產(chǎn)生，致使豬瘟保護性抗體水平低下，同時卻產(chǎn)生大量的BVDV抗體，導致豬瘟免疫失敗。由于現(xiàn)在部分廠家的豬瘟抗體檢測試劑盒不能有效區(qū)分豬瘟抗體和BVDV抗體，所以就會出現(xiàn)明明檢測出很高的豬瘟抗體，但豬群仍然會暴發(fā)豬瘟的情況。而其實檢測出的抗體中，真正的豬瘟保護抗體很少，大部分可能為BVDV抗體。

3.3 北京世紀元亨公司的牛病毒性腹瀉病毒PCR試劑盒不能區(qū)分是豬源BVDV還是牛源BVDV，所以本試驗的檢測結果也不能分辨陽性樣品是豬源BVDV還是牛源BVDV；本試劑盒也不能對BVDV1和BVDV2血清型進行區(qū)別。

3.4 據(jù)報道顯示，目前還未發(fā)現(xiàn)PCV1對豬群有致病性。PCV2感染會損害患畜的免疫器官，降低機體免疫力，導致其他疾病的繼發(fā)感染；尤其是公豬感染PCV2后會通過精液傳播給母豬群，導致豬群迅速感染，這是豬群中潛在的傳播方式。所以使用有PCV2污染的疫苗對豬群進行免疫，將對豬群造成極其嚴重的危害。

[1]王新平，周緒斌.豬感染牛病毒性腹瀉病毒的研究進展[J].動物醫(yī)學進展，1998，19（1）：5-8.

[2]王新平，涂長春，李紅衛(wèi)，等.從疑似豬瘟病料中檢出牛病毒性腹瀉病毒[J].中國獸醫(yī)學報，1996，16（4）：341-345.

[3]應蓓蓓，吳維壽.生物制品中支原體污染的快速檢測[J].高技術通訊，1999，9（5）：53-56.

[4]黃凱，張俊杰，劉英霞，等.北京地區(qū)規(guī)?；鯞VDV持續(xù)感染牛清除方案的初步實施 [J].中國動物檢疫，2010，（5）：34-35.