重組DNA技術及其在動物科學中的應用

劉紅珍 （山東省鄄城縣畜牧局 274600） 李艷 （山東省胸科醫院 濟南） 李穎 （山東省濟南動物疫病預防與控制中心）

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重組DNA技術及其在動物科學中的應用

劉紅珍 （山東省鄄城縣畜牧局 274600） 李艷 （山東省胸科醫院 濟南） 李穎*（山東省濟南動物疫病預防與控制中心）

DNA重組技術是基因工程的核心，指在體外條件下，將不同生物的基因進行入工“剪切”“組合”和“拼接”，使遺傳物質重新構建，然后通過載體轉入受體細胞內并使所需要的基因在受體細胞內表達，DNA重組技術涉及核酸分子雜交技術、PCR反應、限制性核酸內切酶等工具酶的應用、基因轉移等多項技術方法，本文就該技術在實驗動物科學中的應用作一綜述。

重組DNA技術屬于遺傳工程分子水平的遺傳操作，是一種按照人的意志定向改變生物遺傳性狀的技術。廣義的遺傳工程包括細胞水平的遺傳操作(稱為細胞工程)和分子水平的遺傳操作(稱為重組DNA技術)。狹義的遺傳工程就是重組DNA技術[1]，重組DNA技術是在體外重新組合DNA分子(脫氧核糖核酸)，并使其在適當的細胞中增殖的遺傳操作，這種操作可將特定的基因組合到載體上，并使其在受體細胞中增殖和表達。因此，它不受親緣關系限制，為分子遺傳學和育種學以及醫學遺傳學研究開辟了嶄新途徑。

1 重組DNA技術基本過程

1.1 用入工方法取得或合成目的基因 基因是含特定遺傳信息的核苷酸序列，是遺傳物質的最小功能單位，基因可被分離出來[2]。例如，從大腸桿菌中可將乳糖發酵基因分離出來。先利用兩種有差異的親緣關系相近的溫和噬菌體分別感染兩類大腸桿菌，噬菌體的DNA可與大腸桿菌的染色體發生整合。整合位置恰好都在含乳糖發酵基因DNA片段，但方向相反，整合到大腸桿菌中的噬菌體DNA得到復制，用紫外線刺激大腸桿菌，使帶乳糖發酵基因的噬菌體，DNA可以從大腸桿菌染色體中脫出，形成帶乳糖發酵基因的噬菌體。兩種親緣關系相近的溫和噬菌體，通過加熱使其DNA片段雙鏈分開，形成單鏈DNA。進一步將兩種噬菌體DNA單鏈混合在一起，根據堿基互補配對原則，互補的堿基配對成雙鏈，不能配對的為單鏈。然后，用外切酶把單鏈DNA切斷，單鏈被分解，保留了雙鏈乳糖發酵基因。

基因的合成主要有化學合成和酶促合成兩種方法。（1）化學合成：例如胰島素，已知胰島素分子由51個氨基酸組成，它可分為A鏈和B鏈，A鏈由21個氨基酸組成，B鏈由30個氨基酸組成，可用遺傳密碼推導出決定A、B鏈DNA上的堿基對排列進行入工合成。（2）酶促合成是利用限制性內切酶和逆轉錄酶獲得DNA基因片段的方法。目前已從微生物中提純出600多種限制性內切酶，其中常用的只有數十種，用這種酶可獲得目的基因。真核生物，特別是高等動物和植物的結構基因是不連續的“間斷基因”，即DNA可以在內切酶作用下被切斷，無編碼意義的內含子被酶分解；而有編碼意義的外顯子由連接酶連接并轉錄為mRNA，可利用逆轉錄酶得到有關的cDNA基因片段。這種基因片段，是不含內含子而只有外顯子的cDNA。例如兔血紅蛋白基因提取，就是利用逆轉錄酶作用于mRNA取得相應cDNA[2]。用上述方法也可以得到胰島素、絲心蛋白等基因。

1.2 運載體的選擇 運載體的作用是將分離或合成的基因導入細胞或能轉移染色體上的DNA片段，所以必須能自由出入細胞，常用的載體有SV40病毒、溫和噬菌體和質粒等，但最常用的是質粒。質粒是染色體以外能夠自主復制的遺傳單元，是由雙鏈DNA分子組成，呈環狀結構。可以游離于細胞漿中，也可與染色體整合在一起，沒有蛋白質外套，是裸露的DNA分子，比染色體小，只帶數個或數10個基因，最大的也只有大約100個基因，上面有一個位點稱為原點，可以攜帶染色體轉移。

1.3 質粒的分離與重組DNA 用溶菌酶裂解菌細胞分離出質粒。用內切酶處理質粒，使其DNA在一定位置上斷裂，并在斷裂口出現粘性末端。用同樣的內切酶處理分離出的目的基因的DNA，使之具有相同的粘性末端與質粒粘性末端相連接，形成重組DNA穩定結構。將重組DNA導入不含質粒的細菌，即受體細菌中，例如大腸桿菌中，目的基因能隨質粒復制而復制，并隨細菌的分裂而擴增，形成這一基因的無性繁殖系重組DNA克隆化。

1.4 重組DNA的表達 在加入適量四環素的選擇培養基上，例如抗四環素基因的質粒十胰島素基因的重組DNA，可以在大腸桿菌中復制，擴增產生大量胰島素。

2 核酸分子雜交技術及PCR反應在動物科學中的應用

2.1 實驗動物微生物學檢測 傳統的方法多是以免疫學方法檢測病原體抗原及其在動物體內產生的抗體，或者使用不同的方法分離培養微生物，有時存在靈敏度特異性低及速度慢等問題，有的病原體侵入機體后需潛伏一定時間后才出現抗體，用免疫學方法很難及時檢測出來，一些持續感染卻不能積極產生病毒顆粒的病毒，通過檢測抗原的方法，難以檢測到病毒，有的病毒的血清學檢測只能確定是否接觸過這種病毒，但不能肯定是否存在現行感染。核酸分子雜交技術可克服以上不足，并可用于動物群體的大量檢測工作，其靈敏度很高，尤其是PCR反應，有時甚至存在一個病原體即可檢出，其取材范圍廣，可從動物的血、尿、糞便、分泌物、體液、涂片、活檢或尸解標本中直接檢測，也可應用組織培養或細菌培養標本、組織切片檢測。同時，目前已有大量的基因探針、寡核苷酸引物可供檢測使用，運用這些探針、引物進行核酸分子雜交、PCR反應，可以對大量的病原體(病毒、細菌、寄生蟲)進行檢測。據不完全統計，在實驗動物有關病原體方面，已進行了EB病毒、狂犬病毒、流行性出血熱病毒、巨細胞病毒(CMV)、輪狀病毒、細小病毒、腺病毒、慢病毒、鼠沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎支原體、弓形體等的應用研究[3，4]。YasukoK等對入工感染鼠肝炎病毒MHV-JHM小鼠的組織進行了PCR檢測，小鼠腹腔接種病毒后僅ld，即可從感染鼠的肝及腦組織中擴增出其病毒核酸，而以ELISA法進行MHV抗體的檢測，在接種后6d仍呈陰性，表明PCR是實驗動物鼠肝炎病毒檢測的敏感方法[5]。

2.2 實驗動物遺傳學檢測 在生物進化過程中，由于各種原因引起DNA內核苷酸排列順序改變，當這種改變涉及到限制性內切酶識別位點時，利用限制性內切酶可將DNA切割成不同長度的限制性片段。這些具有不同長度的限制性片段類型在人或動物群體中所呈現的多態分布現象就稱為限制性片段長度多態性(RFLP)。RFLP在實驗動物遺傳孕研究中具有重要作用，可以據此繪制各品系動物的基因組限制性內切酶圖譜，以研究各品系動物的起源、分化和血緣關系。史順娣和王昔舟等分別對KM小鼠及我國自行培育的三種近交系小鼠(TA1、TA2、615)的線粒體DNA(mt DNA)進行了酶切電泳分析，其結果顯示KM、TA1、TA2、615與DBA/2，C67BL/6的mt DNA內切酶圖譜一致，表明它們具有相同的起源，即起源于歐州的野鼠Mus musculus domesticus[6,7]。引入注目的是DNA指紋分析法的出現使得RFLP的原理在近郊系動物品系的遺傳學純度及遺傳學質量檢測中得以應用。1985年英國遺傳學家Jeffery等入在入體基因組DNA中發現了高度可變的小衛星區域，這些小衛星DNA的高可變區是由頭尾相連的串聯重復序列組成，其核心序列同源性很高，高可變區的一長度由于串聯重復序列的重復次數不同而有很大的差別，這樣的重復序列被命名為VNTR(Variable number of tandem repeat)，串聯重復次數的不同，酶切割DNA的片段長度也不同，這些片斷經小衛星DNA探針進行southern雜交后顯示出豐富的RFLP。同一個體的不同組織來源的DNA的譜帶完全一致，而不同個體之間(除非同卵雙生)譜帶都不相同，如同入的指紋具有高度個體特異性一樣。因此，這種southern雜交圖被稱為DNA指紋(finger pint)[7,8]。此項技術首先在法醫學領域中應用于親子鑒定及罪犯的確認，進一步研究發現小衛星DNA串聯重復序列也存在于其它哺乳類動物基因組，且其核心順序高度同源，這就為在品系內具有個體間基因型一致性的近交系動物遺傳純度檢測提供了理論依據。Rbert J.Russell等利用DNA指紋分析對近交系大、小鼠進行了遺傳學檢測。其方法為從各品系動物的尾尖或肝提取DNA，經限制性內切酶酶切后，利用入源性的小衛星DNA核心順序33.6作為探針，以Southern法進行雜交，其結果12個近交系大鼠品系均有自己獨特的DNA指紋，而同一品系內各個體的DNA指紋相同。經生化標志物檢測證實發生了遺傳污染的近交系大鼠Lou/IaP的DNA指紋呈現變異。小鼠近交系品系間也具有自己獨特的品系 DNA指紋，一些同源近交系間的DNA指紋可相互區別，但C57BL/6與CBA/ca的雜交F1的DNA指紋不能與C57BL/6區別。通過生化標志檢測未能檢測到疑為發生了遺傳污染的MRI/MP-lpr小鼠的遺傳變異，經DNA指紋分析后清楚地證實了其遺傳污染。Tetsuo kunieda等利用人肌紅蛋白小衛星DNA核心序列(MYO)作為探針，對近交系大鼠進行了DNA指紋分析，結果表明15個近交系大鼠品系間的DNA指紋完全不同，而同一品系內不同個體的DNA指紋完全相同。來源于同一品系內的兩個亞系的DNA指紋也相同，表明動物經歷數代繁殖后，DNA指紋仍呈現相對穩定。根據上述研究結果，研究者認為DNA指紋分析是近交系動物遺傳學檢測的一種簡單、快速、有用的新型檢測方法，具有良好的應用前景[11]。

3 轉基因動物

基因轉移是用物理的、化學的、生物的手段將外源基因導入受體細胞并使之表達的一種技術，它包括體細胞基因轉移及生殖細胞基因轉移，后者即為轉基因動物的建立，故轉基因動物(transgenic animal)是指那些在其基因組內穩定地整合進以實驗方法導入的外源基因，并能遺傳給后代的一類動物。轉基因動物建立的技術過程依次為。分離編碼某一目的產物的基因，或者分離對動物表型有作用的某一基因；制備DNA重組子使其能在選定的組織內表達，從而繞過正常存在于動物機體的代謝過程；將DNA重組子在體外轉移至一個剛剛受精的單細胞卵中(導入方法包括微注射法、逆轉錄病毒感染法、精子載入法、電轉移法、胚胎干細胞介導法)；經處理的卵重新植入適當的受體中；子代性狀的分析[12]。轉基因動物的研究雖然只有10多年的歷史，但它取得的成就已舉世公認，并越來越受到重視，轉基因動物研究與不同學科的結合，開創了許多具有重大理論和應用價值的研究方向，解決了一些其它技術所不能解決的問題。下面列舉幾個方面來闡述轉基因動物研究的意義及應用情況：（1）基因表達與調控；轉基因動物為基因發育階段性表達和組織特異性表達提供了一個極好的實驗體系，將不同的基因片段重組子注射入受精卵，研究其在轉基因動物中的整合表達，對證實某些DNA序列的作用是非常有用的手段[13]。（2）免疫學研究：利用轉入19基因小鼠制備入單抗，使我們在制備入單抗時，不受抗原免疫的限制：導入人MHC基因為研究第I類和第II類組織相容性抗原的功能提供了新的手段[14]。（3）人類疾病模型的建立：如轉入人Huntington舞蹈病基因的小鼠，可以產生舞蹈病；將BPV(DNA腫瘤病毒)導入的轉基因動物中誘發了皮膚癌；用癌基因建立的轉基因小鼠自發腫瘤，致瘤性可轉遞給后代；用乙型肝炎病毒基因建立的轉基因小鼠組織中表達HBsAg mRNA；用HIV基因建立的轉基因小鼠可出現HIV抗體、HIVg120外膜蛋白及逆轉錄酶等[15,16]。（4）動物優良品種的培育：將優良性狀的基因導入動物生殖系，開辟了培育優良動物新品種的新途徑。當首次將生長激素基因導入小鼠，得到了比原來個體大幾倍的“超級小鼠”時[17]，也許人們就認識到轉基因動物在遺傳育種方面的劃時代約意義。目前已經得到的轉基因動物除小鼠外，還有轉基因兔、羊、豬等，我國水生生物研究所朱作言等將人生長激素基因轉入到魚受精卵后，得到了轉基因魚，其個體比對照組有顯著增加[19,20]。（5）作為生物反應器：在發育成的轉基因動物體液或血液中收獲基因產物，即所謂的“生物反應器”，如t-PA(纖溶酶原激活因子)是治療血栓的一種有效藥物，Westpllal等將該蛋白的基因修飾后，在建立的轉基因小鼠分泌的乳汁中，檢測到了人t-PA，除t-PA外，因子XII和a1抗胰蛋白酶也在轉基因綿羊奶中得到了表達，羊奶的重要成份β－乳球蛋白也在其轉基因小鼠的乳汁中表達[21]。

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（2012–09–20）

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1007-1733(2012)12-0090-03