豬偽狂犬病診斷檢測方法研究進展

蘇秀華 張衍俊 （山東省嘉祥縣畜牧獸醫局 272400） 鄭麗艷 （山東省嘉祥縣科學技術局）

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豬偽狂犬病診斷檢測方法研究進展

蘇秀華 張衍俊 （山東省嘉祥縣畜牧獸醫局 272400） 鄭麗艷 （山東省嘉祥縣科學技術局）

偽狂犬病是由偽狂犬病毒(PRV)引起，最早發現于美國，因臨床表現與狂犬病類似，故稱偽狂犬病。該病在全球范圍內的流行呈上升趨勢，世界上已有50多個國家和地區報導該病的流行。我國自1947年劉永純從豬體分離到PRV以來，已有24個省(市)、自治區報導流行。本文主要對血清學、分子生物學診斷與檢測方法，以及鑒別診斷方法進行了綜述。

1 臨床診斷和病理組織學檢測

成年豬無明顯癥狀，母豬流產或產死胎，仔豬表現神經癥狀，肌肉震顫，嚴重時四肢劃水樣運動，體溫升高達41~42℃。取樣本的腦和脊髓做組織切片，蘇木素-伊紅染色后觀察呈現非化膿性腦炎變化，其他大體剖檢特征不明顯。在神經細胞、膠質細胞和毛細血管內皮細胞可檢出A型核內包涵體。

2 病原學診斷技術

此種方法也被稱為診斷PRV的黃金標準。病毒分離時可以采集病豬的組織有：腎臟、腦、肝、脾及扁桃體，勻漿后加上雙抗，接種到敏感細胞，直至出現特征性細胞病變(CPE)。這種方法的敏感性較差[1]。

3 核酸探針檢測技術

探針技術由于其具有特異性良好、敏感程度高的優點，廣泛用于PRV的診斷和檢測中。Rirtle等首次使用核酸探針技術鑒定了野外分離的PRV，從而獲得了流行病學的研究資料。其后，用生物素和地高辛標記的探針從三叉神經節診斷出PRV DNA，并進行了原位雜交，從單細胞的水平上檢出存在的潛伏感染。國內也存在利用探針檢測技術的研究，采用32P探針標記PRV全基因組和重組質粒應用斑點雜交技術，從而獲取培養物中的PRV存在的信息，能檢測出10pg的PRV–DNA，并具有較高的特異性[2]。

4 聚合酶鏈式反應(PCR)檢測技術

4.1 常規PCR 目前，主要根據病毒生存必須的糖蛋白基因和毒力基因為模板設計引物，檢測的基因片段主要有gB、gD、gG和gE等，其中gD基因是該病毒的主要中和抗原基因。如Echeverria M G等以PRVgD基因為模板設計了一對引物，利用PCR法對19頭豬的組織樣本進行了檢測，結果表明有15頭PCR反應陽性，而病毒分離只得到了3株PRV。周復春等應用PCR技術進行了PRV的檢測，并對潛伏的感染部位也進行了相應的研究。其中檢出率最高的組織為三叉神經節，幾乎為100%[3]。石建平等對常規PCR法進行了改進，提高PCR的效率，使PCR技術更趨于實用化，根據gD基因設計一對引物，選用高速離心和短時間100℃水浴釋放模板，將試驗縮短到4h內完成[4]。陳本龍等(2009)根據gD基因設計引物，成功建立了檢測PRV的PCR體系[5]。

4.2 鑒別PCR Katz(1992)根據gE、TK基因設計的套式PCR能將PRV野毒株和不同疫苗株有效地鑒別開[6]。劉麗娜等設計了與PRV的gB、gD、gE基因的3對引物，建立了能有效區分野毒株和基因缺失疫苗毒的多重PCR診斷方法，敏感性試驗結果表明，多重PCR可以檢測到106pg三基因缺失疫苗毒或756pg PRV野毒的核酸模板量[7]。

5 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

酶聯免疫吸附試驗適用于實驗室大批樣品檢查，產地檢疫，流行病學調查和無本病健康豬群的建立，目前，國際上有各種商品化ELISA試劑盒出售。Mout (1978)[8]、Afshar(1987)[9]等分別建立了檢測偽狂犬病病毒抗體的間接ELISA方法。國內蔣玉雯等(1988)[10]建立了檢測偽狂犬病病毒抗體間接ELISA方法，認為ELISA敏感性高，且快速、簡便，適于大面積血清學調查。王勇等用gE鑒別ELISA試劑盒調查某豬場流行情況，母豬陽性率為81%，但缺點是此種方法費用昂貴，難以在基層推廣[11]。

6 乳膠凝集實驗技術(LA)

乳膠試驗凝集技術是利用抗原和抗體特異性結合的特點，將抗原先用乳膠包被，然后再與相應血清反應，幾分鐘內即可得出結果。王澤州等于2001年報道利用此種方法對四川省的20個豬場進行了血清檢測，陽性率為14.7%，少數豬場陽性率達到95%。羅勇等利用乳膠凝膠實驗技術對疑似豬瘟病的病豬進行了豬偽狂犬病毒的檢測，230份血清中陽性率11%[12]。

7 血清中和實驗技術(SNT)

SN是檢測病毒比較經典的血清學方法，應用比較方便，很多國家都采用此法檢測PRV。Boelaert(1999)應用SN對比利時北部地區4個豬場的母豬進行了血清學調查，血清陽性率分別為68%、60%、43%、18%[13]。李曉慧等采用SN和LAT兩種方法對吉林省8個地區1050份血清進行了檢測，確定吉林省PR血清陽性率為21.7%，兩種方法血清檢出率經統計學分析準確性差異不顯著[14]。邱德新等應用血清中和實驗(SNT)和偽狂犬病乳膠凝集實驗(LAT)診斷試劑盒進行了PRV抗體效價測定和相關性分析，結果表明兩種方法檢測結果符合率高，特異性強，LAT比SNT敏感、快速簡便和實用[15]。

8 瓊脂免疫擴散試驗(AGID)

Gutekunst D E(1997)首次報道了利用微量瓊擴試驗檢查豬血清中PRV抗體，由于AGID技術操作簡單。結果準確，無需特殊設備，與SNT技術相比有很大的優勢，因此適用于基層獸研單位和大型豬場的現場定性診斷及豬群隱性無感染的普查。吳斌等(1997)將AGID和SNT進行了比較試驗，發現與SNT的陽性符合率為94%，可以作為一種檢測偽狂犬病和抗體水平的檢測。代明娟等(2002)利用AGID技術對5個豬場進行了抗體檢測，結果分析表明豬場的血清陽性率為80.0%，再一次顯示了AGID技術的簡便和快捷[16]。

9 結語

目前，可以用來診斷豬PRV的多種檢測手段中，傳統檢測手段可靠，但往往操作較復雜，或耗時較長，實際應用中有一定的困難。血清學檢測手段，尤其是研制成功的部分ELISA試劑盒操作簡單，方便，不需要使用昂貴復雜的儀器，已經被廣泛應用，特別是鑒別ELISA試劑盒可鑒別野毒感染和已免疫動物，但一些ELISA方法還不夠完善。分子生物學方法特別是PCR技術，隨著研究的深入將更加趨于敏感、簡便、快速、實用。建立和完善用于我國的PR控制和消滅該病的診斷方法，是我國廣大獸醫科研工作者面臨的重大課題之一。

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（2012–10–11）

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