傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定

葉敬禮 （江蘇省宿遷市宿豫區農業委員會 223800）

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傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定

葉敬禮 （江蘇省宿遷市宿豫區農業委員會 223800）

豬高熱綜合征是近年來由多種病原混合感染和繼發感染引起的一種以發熱、皮膚發紅、出現呼吸道和繁殖障礙等為主要特征的綜合征。其中胸膜肺炎放線桿菌(APP)是引起呼吸道癥狀并加大治療難度的重要病原之一。APP引起的豬傳染性胸膜肺炎，是一種高度接觸傳染性呼吸道疾病，給世界各地的養豬業造成了巨大的經濟損失。本試驗對豬高熱綜合征中胸膜肺炎放線桿菌的感染進行了初步研究，分離鑒定了10株胸膜肺炎放線桿菌，為高熱綜合征的控制和治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 病料 2010年9月至2012年5月，從宿豫區發生高熱綜合征的56個豬場共采集豬病料142份，其中肺50份、關節液30份、心血40份、腦8份、脾臟6份、淋巴結5份和濃汁3份。

1.2 主要試劑及儀器 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),購自中國醫藥(集團)上海化學試劑公司。犢牛血清自制。胰蛋白大豆瓊脂(TSA)購自Difco公司。微量生化簽定試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司。TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker均購自寶生物（大連）有限公司。凝膠成像系統、電泳儀均為Bio-Rad公司產品。PCR擴增儀為Touchgene公司產品。

1.3 分離鑒定 （1）將病料接種于含NDA和血清的TSA固體培養基，置于5%CO2，37℃培養24~48h；挑取圓形、光滑濕潤、無色透明、直徑1~2mm的可以菌落，進行純培養。（2）將可以菌落的純培養物分別接種不含NAD和血清的TSA、不含NAD単含血清的TSA的平板，觀察菌落生長情況和形態大小。（3）將可疑菌落的純培養物接種生化鑒定管，生化鑒定管中同時加入5ml0.01%的NAD和5ml血清，置于37℃、5%的CO2培養基，培養48h觀察結果。（4）PCR鑒定：參照華中農業大學陳凡碩士論文，根據APP apx IV(No.gi: 6671147)序列設計引物，PCR擴增的產物為377bp大小的片段，引物由上海生工公司合成。上游引物5'-GCTCACGAACGTTT-GCTCAT-3'，下游引物5'-GGGGACGTAA CTCGGT-GATT-3'，反應體系(50ml）：10×緩沖液50ml，2mmol/L dNTPs 1ml，10umol/ L/L上下游引物各1ml，滅菌ddH2O40ml。反應條件：94℃ 1min，59℃1min，72℃30s，共35個循環；最后72℃延伸10min。PCR產物1.0%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結果

2.1 培養特性與鏡檢 在加有血清和NAD的TSA培養基上24h長成半透明菌落，針尖大小，直徑1~2mm,側對光線有虹光。在不含NAD和血清的TSA培養基、不含NAD但含血清的TSA培養基上均不能生長。表明分離的菌株具有NAD依賴性。在血小板上48h長成針尖大小的半透明菌落，多散在，少量短鏈狀或長鏈狀。

2.2 生化實驗 生化實驗結果表明，分離的可疑菌脲酶試驗陽性，CAMP試驗陽性，糖發酵試驗結果為木糖陽性、葡萄糖陽性、甘露醇陽性、蔗糖陽性、阿拉伯糖陽性、乳糖陰性。

2.3 PCR鑒定 對上述經鑒定的10株可疑菌進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳，證實大小均與預期大小一致。

3 討論

本試驗從大量臨床病料中分離到10株胸膜肺炎放線桿菌，分離率較低，究其原因，一是近年來呼吸道癥狀日益突出，病原復雜，胸膜肺炎放線桿菌的因素只是其一；二是胸膜肺炎放線桿菌較難分離；三是絕大部分臨床病料都是經過抗生素治療，降低了分離效率。因此分離細菌性病原應選取發病初期、癥狀典型且未經抗生素治療的病例，并且使用合適的培養基、科學的分離鑒定方法，才能客觀真實地反映感染情況，提高分離效率。

（2012–11–11）

S853..61+2

B

1007-1733(2012)12-0105-02