畜產品中四環素類抗生素殘留的檢測技術

劉 博，曹小妹，宋合興，尹 航，高文惠

（河北科技大學生物科學與工程學院，石家莊 050018）

由于在飼養過程中獸藥及飼料添加劑的大量使用而造成畜產品中藥物殘留，尤其是抗生素的殘留，對人體的影響很大。研究發現，殘留的抗生素對敏感的人能產生過敏反應；有些導致人的再生障礙性貧血；甚至導致人體產生耐藥性，引起食源性感染和二重感染，造成中毒反應、致畸和致殘等一系列危害。

畜產品中常見的抗生素有四環素類、青霉素類等。四環素類抗生素（TCs）是由鏈霉菌產生的一類廣譜抗生素，主要有四環素（TC）、金霉素（CTC）、土霉素（OTC）、多西環素（DOTC）和美他環素（METC）等。四環族抗生素屬快效抑菌劑，其作用機制主要為抑制細菌肽鏈的增長和蛋白質的合成，并能引起細菌細胞膜通透性改變，從而抑制DNA復制。四環族抗生素的抗菌譜很廣，除對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌等革蘭陽性菌及腸球菌、淋球菌等革蘭氏陰性菌敏感外，對立克次體、支原體、衣原體屬等非典型致病菌也有較好的抑菌作用[1]。

四環素類抗生素常用的是土霉素、四環素、金霉素、強力霉素等，因其價格便宜、抗菌譜廣、抗菌力強、除被作為飼料添加劑以維持畜禽的健康并加速其生長外，還被廣泛應用于動物各種傳染性疾病的預防和治療。美國FDA規定四環素在豬肉中的殘留量應＜80 μg·kg-1；國際衛生組織和歐盟規定四環素在豬肉中的最大殘留量應≤100 μg·kg-1；我國在無公害畜禽肉安全要求中規定的最高限量為100 μg·kg-1[2]。畜產品的四環素類抗生素殘留，已經對人類健康構成潛在危害。因此，人們也在不斷地對四環素類抗生素的檢測技術進行研究和探索。本文總結了畜產品中殘留的四環素類抗生素常規檢測方法及新探索的方法。

1 微生物方法

微生物檢測法是應用最早的方法，其測定原理是根據抗生素對微生物的生理機能、代謝的抑制作用來定性或定量確定樣品中抗微生物藥物殘留，如紙片法（PD）、抑制法（TTC）。PD法是當樣品中存在抑菌物質時，在紙片周圍形成一個清晰的抑菌圈，在檢測過程中培養基內加入溴甲酚紫指示劑，則形成淺藍色的抑菌圈。TTC法即國標嗜熱鏈球菌抑制法，其原理是1，2，3，5-氯化三苯四氮唑（TTC）會與活菌體內的琥珀酸脫氫酶反應，生成紅色的代謝產物。將液體乳高溫殺菌后添加嗜熱鏈球菌菌液，37℃培養一段時間后加入TTC進行顯色。若該液體乳樣品中不含抗生素或含量低于檢測限，嗜熱鏈球菌會繼續增殖將還原并產生紅色物質（陰性結果）；相反，若樣品中含有高于檢測限的抗生素，則菌體生長受到抑制，指示劑TTC不能被還原，檢測試管將保持其液體乳原有的白色（陽性結果）。TTC法是較早用于液體乳中抗生素殘留定性檢測的方法，也是我國實驗室里普遍使用的方法。其成本低廉、操作簡單，但由于需要增菌步驟，需要長時間才能完成檢測。對于四環素族的抗生素，該方法的檢出限為100 μg·mL-1。黃曉蓉等介紹了一種同時使用藤黃微球菌、枯草芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌蕈狀變種為敏感菌，一次操作可同時檢測在肉類、水產品及蛋中的4大類抗生素殘留的微生物抑制方法，該方法四環素類的測定低限為0.1 mg·kg-1[2]。

2 薄層色譜法

薄層色譜法（TLC法）經常作為樣品篩選方法，其優點是速度快，可以同時在多快板上點樣，處理大批量樣品的時間短，溶劑用量少，不需要復雜的儀器，有利于現場用，但仍需要復雜的樣品前處理，且靈感度不高，不易定量，重現性不好。該方法一般使用硅膠板，用混合溶劑作展開劑，晾干后用一定的顯色劑噴霧顯色（顯色可采用生物自顯影法和化學法），用紫外檢測器（UVD）或串聯熒光檢測器（FLD）檢測。薄層色譜法檢測已用于肌肉組織和蜂蜜中的四環素檢測[3]。

3 分光光度法

分光光度法的原理是利用四環素本身在紫外區有很強的吸收，在一定的pH條件下，通過測定其吸光度而定量測定其含量；利用四環素與一些過渡性金屬離子發生反應，生成有顏色的絡合物，四環素與受電子體物質苯醌類物質發生荷移反應，生成荷移絡合物，根據四環素的吸收光譜發生變化從而定量測定[4]。倪永年等運用動力學分光光度法測得四環素的線性范圍為0.5～7.5 mg·L-1，檢測限為0.23 mg·L-1[5]。

3.1 紫外光譜法

紫外光譜法具有快速、簡便、易于操作、設備簡單、造價低等特點，非常適合抗生素的快速檢測。田益玲等將鮮乳用乙腈沉淀法去除乳蛋白后，在278 nm下測得其吸光度，然后根據工作曲線計算得到四環素的線性范圍為0.03～115.0 mg·L-1，檢出限為0.003 mg·L-1，相對標準偏差（RSD）為1.05%，該法與國標TTC法相比檢出限低兩個數量級。

3.2 熒光-紫外結合的分光光度法

熒光-紫外結合的分光光度法方法簡便、分析精度高，但靈敏度不高。熒光法靈敏度高，但四環素類抗生素屬于弱熒光物質，不能在熒光計上直接檢測。高紅等提出一種新的兩者結合的測定四環素類抗生素的方法，運用該技術實現了在熒光計上直接檢測四環素類抗生素，測得四環素類抗生素的線性范圍均為0.10～9.00 μg·mL-1，四環素、土霉素、金霉素和多西環素的檢測限分別為0.065、0.067、0.068和0.070 μg·mL-1[6]。另外，測定四環素的還有溴化十六烷基三甲基銨熒光法，其檢測下限為 0.001 μg·mL-1，線性范圍 0.01～12.0 μg·mL-1[7]。熒光法在測定牛奶中四環素也有應用[8]。

4 流動注射化學發光法

化學發光法的原理是四環素在堿性或酸性條件下可以降解，其降解產物可以和一些氧化劑如鐵氰化鉀、過氧化氫等發生反應而產生化學發光，另外一些金屬離子如Cu2+等可以催化該化學發光反應。流動注射化學發光分析法具有靈敏度高、線性范圍寬（一般可檢測到μg·kg-1甚至ng·kg-1級，線性范圍可達10-4數量級），重現性好，樣品處理及儀器操作簡單等優點，而被廣泛用于藥物的直接測定，也可實現四環素殘留量的快速測定。但是由于化學發光分析選擇性差、干擾因素多而限制了其使用，只要對這方面深入的研究以及不斷排除干擾因素，將有望成為測定四環素殘留量的較好方法。

賈寶秀等根據在酸性介質中，高錳酸鉀能氧化四環素產生化學發光，甲醛能顯著增強該體系的發光強度而建立了一種簡單快速檢測四環素的流動注射化學發光新方法，在最佳試驗條件下，測定四環素的線性范圍為0～60.0 μg·mL-1，檢出限為 0.28 μg·mL-1，對 20.0 μg·mL-1四環素標準液進行11次平行測定，其相對標準偏差為1.3%[9]。

5 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）法是用高壓流動相的驅動使樣品通過高性能層析柱，從而使樣品中的抗生素得到高效率分離。因其具有高性能的檢測設備和先進的操作控制系統，而確保了該方法有很高的靈敏度、自動化程度高、結果重復性好，進而使得HPLC成為目前檢測抗生素殘留廣泛應用的一種方法。高效液相色譜法廣泛應用于畜禽肉、牛奶、動物組織等的四環素檢測。

5.1 高效液相色譜測定的樣品前處理方法

高效液相色譜常用的樣品前處理方法有固相萃取、凝膠滲透色譜凈化、基體分散固相萃取[10]。農以寧等用比表面積較大，具有較強吸附能力的多壁碳納米管的固相萃取-高效液相色譜（SPE-HPLC）方法同時測定了豬肉中四環素族，采用Oasis HLB固相萃取柱凈化萃取，Diamonsil TM C18色譜柱分離，磷酸鹽緩沖液（pH至2.5）-乙腈梯度洗脫，檢測波長245 nm，結果表明，土霉素、四環索、金霉素測定的線性范圍均為2～12 μg·mL-1，基底加標回收率為93.6%～96.1%[11]。多壁碳納米管在固相萃取領域會有很好的發展前景。凝膠滲透色譜（GPC）方法是一種主要基于分子大小的原理進行分離樣品的凈化技術，其具有重現性好回收率高，適用于多殘留分析等特點。謝維平等利用凝膠滲透色譜凈化-高效液相色譜法同時測定了動物源性食品中四環素、土霉素、金霉素藥物的殘留，檢測限為11～33 μg·kg-1，平均加標回收率為51.9%～95.2%，相對標準偏差3.4%～6.7%[12]。

5.2 高效液相色譜的檢測器

高效液相色譜常見的檢測器有熒光檢測器、二極管陣列檢測器、紫外檢測器[13-16]。徐威等利用高效液相熒光檢測方法檢測動物性食品中土霉素和四環素殘留。方法樣品經含乙二胺四乙酸二鈉的丁二酸鈉緩沖液除蛋白后，由SPE-醋小柱提純凈化，ODS-醋柱分離，8%氧氯化鋯溶液柱后衍生化，在激發波長406 nm和發射波長515 nm處檢測土霉素和四環素與鋯離子的螯合物含量，本方法穩定、快速、靈敏地檢測到的結果為土霉素和四環素的回收率分別為89.59%和92.59%，最低檢出濃度（信噪比5∶1）分別為3和5 μg·L-1，線性范圍為10 μg·L-1～10 mg·L-1，相關系數分別為 0.999 和1.0000[13]。傅承光使用常規的反相色譜條件，結合柱后調節pH及膠束增敏，建立熒光檢測方法，進一步提高了靈敏度。4種四環素類藥物同時測定，檢出限達到8.0～75.6 pg水平，適于測定樣品中痕量四環素類藥物[14]。張春艷等應用反相高效液相色譜-二極管檢測器（DAD），測定了乳及奶粉中四環素的含量，四環素濃度在1～100 ng呈良好線性關系，r＞0.9996，平均加標回收率79.6%～102.0%，CVN2.28%～4.57%[15]。蔡穎等利用反相高效液相色譜-紫外檢測測定了乳制品中土霉素、四環素和金霉素殘留量，檢測限分別為土霉素15.0 μg·kg-1，四環素20.0 μg·kg-1、金霉素18.0 μg·kg-1，回收率為86.0%～102.3%[16]。

5.3 高效液相結合化學發光法

化學發光分析法（HPLC-CL）具有靈敏度高、線性范圍寬、儀器設備簡單等優點，加上高效液相色譜具有高效分離的特性，使得HPLC-CL法成為一種有效的痕量及超痕量分析技術。張琰圖等提出了一種高效液相色譜-化學發光法檢測4種四環素類抗生素藥物的新方法，同時分離檢測4種抗生素的總時間為11 min[17]。此方法是基于四環素類抗生素藥物中的四環素、土霉素、金霉素和多西環素能夠強烈增敏通過恒電流電解方法在線電生BrO-和魯米諾之間產生的化學發光，4種抗生素的檢出限為0.002～0.008 μg·mL-1。

5.4 高效液相-質譜聯用法

色譜的優勢在于分離，為混合物的分離提供了最有效的選擇，但其難以得到物質的結構信息，主要依靠與標準物對比來判斷未知物。質譜能夠提供物質的結構信息，用樣量也非常少，但其分析的樣品需要進行純化，具有一定的純度之后才可直接進行分析。高效液相-質譜聯用法（LC-MS-MS）已經廣泛應用在豬肉、牛奶等的檢測[18-21]。

5.5 高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜聯用法

楊紅梅等利用高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜聯用測定乳制品中6種四環素類抗生素的殘留，采用多反應監測正離子模式，可1次對6種四環素類抗生素進行定性和定量分析，該方法的檢出限0.5～4.0 μg·L-1，測定低限牛奶為0.6～4.5 μg·L-1，乳粉為6.0～45.0 μg·kg-1，線性范圍4.0～100.0 μg·L-1，加標回收率56.1%～104.9%，相對標準偏差為2.5%～15.0%，該法具有樣品預處理簡單、靈敏度高、分析時間短等優點[21]。康莉等用高效液相色譜-電噴霧離子源串聯質譜法同時檢測了豬肝樣品中四環素類及克倫特羅藥物的最低檢出限為0.02～0.56 μg·kg-1，樣品平均加標回收率為84.4%～101.7%[22]。孫雷等用高效液相色譜-電噴霧離子源串聯質譜方法檢測了豬肉組織中四環素類藥物的殘留，四環素、土霉素和金霉素在10～400 ng·mL-1濃度范圍內呈現良好線性，相關指數r＞0.999，方法檢測限為5 ng·g-1，定量限為10，50、100和200 ng·g-13個添加濃度的平均回收率為72.3%～94.6%，批內批間RSD均＜20%[23]。

5.6 高效液相色譜-串聯四極桿質譜聯用法

閆龍寶等采用高效液相色譜-串聯四極桿質譜聯用法測定了嬰幼兒配方奶粉中5種四環素類抗生素殘留量，采用電噴霧正離子MRM模式檢測，該方法的檢出限為0.5～1.0 ng·mL-1，方法定量下限為5.0 ～10 μg·kg-1，線性范圍0.5～20.0 ng·mL-1，加標回收率84.2%～92.5%，相對標準偏差為2.20%～4.07%[24]。李月歡等采用超高效液相色譜-電噴霧串聯四極桿質譜儀快速測定畜、禽肉樣品中土霉素、四環素、金霉素的最低檢出限（LOD）分別為0.1、0.1、0.5 μg·kg-1，在5.0～80.0 ng·mL-1的線性范圍內，相關系數r＞0.99，回收率在82.6%～111%，而且電噴霧串聯四極桿質譜的MRM掃描方式抗干擾強，使方法的靈敏度更高，選擇性更好，超高效液相色譜-電噴霧串聯四極桿質譜法適于畜、禽類食品中痕量土霉素、四環素、金霉素的痕量分析[25]。

6 高效毛細管電泳法

高效毛細管電泳法原理是在毛細管柱中充入緩沖溶液，插入處于同一水平的兩個緩沖液槽中，樣品從毛細管的一端（稱進樣端）導入，當毛細管的兩端加上一定的電壓時，帶電溶質便朝與其電荷極性相反的電極方向移動。由于組分間的濃度不同，遷移速度不同，所以經過一定時間后，各組分別將按其速度或濃度大小排序，依次到達檢測器而被檢出，得到按時間分布的電流譜圖。此法具有操作簡單、色譜柱不受樣品污染、分析速度快、分離效率高、樣品用量少、運行成本低等優點[26]。固相萃取-高效毛細管電泳技術可以檢測牛奶中四環素類抗生素，梁佳等采用固相萃取-高效毛細管電泳法（SPE-HPCE）同時檢測了牛奶中四環素、氯霉素、土霉素和金霉素的含量，在15 min內完全分離4種抗生素，檢測限（μg·mL-1）分別為0.5、1.5、1.0、0.5，該方法簡單、可靠，靈敏度高[26]。Israel用建立在二氧化硅吸附劑的基礎上的磁固相萃取-毛細管電泳技術檢測牛奶中的四環素類抗生素[27]。邢曉平運用高效毛細管電泳-電化學檢測法（HPCE-ED）對雞蛋中殘留的四環素、土霉素進行了快速測定分析[28]。韋壽蓮等首次采用柱端射壁電導檢測方法，結合濾波技術以pH 4.0 Tris2Cit為分離介質，用毛細管電泳-電導檢測對土霉素、金霉素、強力霉素和四環素進行了分離[29]。還有膠束電動毛細管色譜技術分離4種四環素類抗生素[30]。

7 免疫分析法

免疫分析法的基本原理是以抗原或半抗原和抗體特異性結合為抗原-抗體復合物的免疫反應為基礎的生化測試技術。免疫分析法主要有放射免疫分析（RIA）、酶免疫分析（EIA）、熒光免疫分析（FIA）和酶聯免疫吸附法（ELISA）。免疫分析技術具有操作簡單快捷、速度快、靈敏度高、分析成本低等優點。此法在蜂蜜中已有應用[31]。

7.1 放射免疫分析法

陸勤等用放射免疫方法檢測了牛奶中四環素類抗生素的殘留，該法檢測牛奶中四環素、土霉素、金霉素3種四環素類藥物的最低濃度可分別達到30、100、50 μg·L-1，RSD＜3.9%（n=6）[32]。

7.2 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附試驗主要是將抗原（或抗體）吸附于固相載體，在載體上進行免疫酶染色，最后底物顯色用肉眼或分光光度計判定結果的一種檢測方法。ELISA檢測技術因其靈敏度高，特異性強，檢測范圍在ng～pg水平，屬于超微量分析技術[33]。其干擾小，抗原抗體的免疫反應特異性強，結構類似物、有色物質、熒光物質對檢測的干擾很小；操作簡便快捷，由于特異性強，簡化了樣品的預處理和提取純化過程，可同時檢測數十甚至上百個樣品；安全性高，污染少，因為靈敏度高，標準品的濃度可以很低，有機溶劑用量較少，減少對檢測人員和環境的潛在危害。但ELISA也存在一些缺陷，如對試劑的選擇性很高，不能同時分析多種成分；對結構類似的化合物有一定程度的交叉反應；分析分子量很小的化合物或很不穩定的化合物有一定的困難。隨著基礎研究的進展、ELISA技術的不斷改進以及用于畜產品藥物殘留量分析ELI?SA試劑盒的大量生產，ELISA方法的優勢將更加突出，更加符合畜產品分析的準確、快速、簡便、易操作的要求。國占寶基于定量檢測動物源性食品中四環素類抗生素的殘留量，開發研制四環素類抗生素競爭酶聯免疫（ELISA）檢測試劑盒線性檢測范圍為0.05～4.05 ng·mL-1，靈敏度為0.05 ng·mL-1[34]。

8 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析檢測方法是基于膠體金免疫技術，試劑條膠體金結合墊上包被微生物受體抗體膠體金復合物，檢測線T分別包被青霉素G抗原和金霉素抗原，控制線C包被微生物受體二抗。當樣品中含有β-內酰胺類和四環素類藥物時，會與檢測線包被抗原競爭結合金標復合物，金標復合物與檢測線包被抗原結合形成紅色線，未與檢測線包被抗原結合的金標復合物移動到控制線與第二抗體結合形成紅色線。檢測線顯色的強度與樣品所含藥物濃度成反比，檢測線淺于控制線為陽性，檢測線深于或等于控制線為陰性，控制線不全或沒有顏色為無效檢測。膠體金免疫層析法的顯著優點是操作簡便快速、靈敏度高、特異性強、可以目測結果。最快可在10 min內就完成一批8份樣品的檢測，大幅提升了檢測速度，并且無需昂貴的儀器，有助于現場檢測和大批量樣品的初篩[35]。該方法在水產品中四環素檢測已有應用。付云潔采用試紙條法檢測金霉素檢測限為0.7 μg·mL-1，在四環素質量濃度＞1.0 μg·mL-1時，與金霉素存在交叉反應性，其結果與高效液相色譜法測定的結果一致，本方法檢測時間僅需5 min，適用于食品中金霉素殘留的快速檢測[36]。

9 生物芯片技術

生物芯片技術是一種以膜、玻璃、硅等固相介質為載體，能快速并行處理多個生物樣品，并對其所包含的各種生物信息進行解析的微型器件，具有快速、高效、并行處理及分析自動化能力，其最大的優點在于高通量、并行化、微型化。在生物芯片上，單位面積內可以高密度地排列大量的生物探針，已經實現產業化的生物芯片可排列5～10萬個探針·cm2。借助生物芯片技術，一次試驗就可同時檢測多種疾病或分析多種生物樣品。目前成為畜產品獸藥殘留檢測的一個高效便捷的平臺，具有極高的推廣價值[37]。Adrian等也應用生物芯片技術對牛奶中的幾種抗生素和四環素進行了檢測[38]。

10 小結

目前高效液相色譜及其與其他檢測方法聯用，已經廣泛于畜產品中四環素類抗生素的檢測。但在我國關于毛細管電泳檢測技術、膠體金免疫層析法和生物芯片技術在畜產品中抗生素的檢測應用報道比較少，隨著這些方法的不斷完善，將會得到廣泛應用。

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