中藥復方有效成分組相關研究方法的研究進展

宋芳嬌 曾克武 王學美

中藥復方是中醫臨床用藥的主要形式，中藥成分復雜，多成分多靶點相互作用是其治病的主要機理。為了研究清楚中藥發揮作用的主要藥效成分，很多學者在中藥化學成分的分析和結構鑒定等方面做了大量的研究。有效成分組的概念是在長期臨床經驗和大量科學研究相結合的情況下提出來的。作為與臨床治療目的密切相關的所有藥理活性成分，有效成分組不僅是保證臨床療效的物質基礎，也是中藥復方制劑質量檢測的重要對象，對中藥的質量檢測和現代化進程有重要意義。近年來，隨著科學技術尤其是藥物分析技術和高通量篩選等技術的發展，中藥復方有效成分組的研究得到了長足的進步，并開拓了良好的前景。

1 中藥復方及其有效成分組概述

中藥復方是指在對疾病辨證論治的基礎上，按照配伍原則將兩味或兩味以上的藥材組成的一組藥物。中藥復方是按照君臣佐使、整體協同的原則進行配制，各種藥效成分有機協同，相互配合達到治療效果，單獨某一活性成分并不一定有明顯的療效。中藥復方有效成分組是指中藥復方中與該復方臨床治療目的密切相關的所有有效物質，是中藥復方制劑質量控制的基本對象［1］。有效成分組的物質來源復雜，包括原味藥材中的固有成分，不同制備過程的形成產物和經體內消化代謝產生的物質［2］。目前由于中藥復方藥效物質基礎不明確，難以進行藥物的質量控制，制約了中藥復方的國際化和現代化進程，因此中藥復方有效成分組學的研究具有重要意義。

有效成分組的概念有別于有效部位和有效成分。有效部位是指一味中藥或中藥復方中的一類或幾類化合物，其含量達到總提取物的50%以上并被認為是治療疾病的有效成分，這一類或者幾類化合物的混合體即被認為是有效部位。有效成分是指天然藥物中代表其功效的一種獨立的化學成分，一般具有明確的化學結構式或物性常數。有效部位和有效成分都不能代表中藥復方中與治療目的密切相關的所有物質，不能解釋有效成分組的整體作用，因而具有局限性。

2 中藥復方有效成分組研究方法

2.1 化合物群分析法

將復方作為一個整體，用現代分離技術將性質相似的化合物群進行分離，如分離成黃酮類、皂苷類、生物堿類，多糖類，所分離的化合物代表復方中所有藥物此種化合物的總和，再對各化合物進一步分析，采用色譜，波譜等多種現代分析鑒定技術，確定化合物中的有效成分。劉斌等［3］對苦參湯生物堿部分進行研究，首次從苦參湯中分離鑒定出8 種化合物，其中苦豆堿為首次在此復方中的苦參、生地黃、黃芩3 味中藥中發現。劉明生等［4］對傳統復方腸胃康進行研究，利用多種柱色譜對復方進行分離純化，再根據理化性質和波譜數據鑒定出化合物結構，首次從腸胃康有效成分組中分離出五種黃酮類化合物。化合物群分析法是復方有效成分組研究的基礎和重要手段，可明確有效成分組中化合物的結構。

2．2 指紋圖譜分析

中藥指紋圖譜分析是一種綜合的、可量化的鑒定手段，是將某些中藥材或中藥制劑經適當處理后，采用一定分析手段，得到能夠標示其化學特征的色譜圖或光譜圖的分析方法。整體性和模糊性是指紋圖譜兩大基本屬性，更加符合中藥復方有效成分鑒定的特色，是順應中藥復方發展應運而生的一種質量控制模式。中藥指紋圖譜需同時具有“共性”和“個性”兩種特性。“共性”應能體現出不同采收時期和不同產地的同一種藥材在某方面的共同特征;“個性”不僅要能反映出該種藥材有別于其他任何物質的特點還要能體現出因產地和采收期不同而造成的差異［5］。中藥指紋圖譜有很多種建立方法:如薄層色譜法(TLC)，氣相色譜法(GC)，高效液相色譜法(HPLC)，高速逆流色譜法(HSCCC)，紫外可見光譜(UV)，紅外光譜(IR)和近紅外光譜(NIR)等。郭秋平等［6］用高效液相法測定11 批百合藥材的指紋圖譜，確立了13 個共有峰，該方法能較為全面的反映出百合的化學成分，為其質量控制提供了有效參考。陳永剛等［7］以C18 色譜柱為分析柱，甲醇－水(含冰乙酸)為流動相梯度洗脫，制備同一色譜條件下蕓香科柑橘屬6 種常用理氣中藥黃酮類成分的液相色譜指紋圖譜。此圖譜可以較為直觀的比較出各特征峰峰高及峰面積的差異。指紋圖譜分析推動了復方有效成分組質量檢測的極大發展。

但在實際應用中，指紋圖譜分析還面臨著很多問題。比如制定標準圖譜時缺乏藥材來源，成藥工藝等各種指標控制;在解決分離和檢測兩大問題方面，前沿新技術應用不夠;實驗室條件，儀器設備的不同會造成指紋圖譜有差異;大量信息的化學計量處理方法還不夠完善等。

2．3 藥物代謝動力學研究方法

中藥藥代動力學是中藥藥理和藥物代謝動力學相融合而成的一門邊緣學科，是中藥現代化的重要組成部分。很多學者在此方面做了大量的研究，采用不同的觀察指標和檢測方法研究中藥成分在體內的代謝變化過程，計算藥代動力學參數。藥代動力學研究為復方有效成分組的體內研究和安全使用奠定了基礎。

2．3．1 血藥濃度測定法

血藥濃度測定法是指在藥物吸收后，通過測定藥物中某一有效成分在血液中的濃度來計算藥物代謝動力學參數方法，主要適用于有效成分明確的中藥。該方法首先采集服藥動物的血液，再用色譜法，免疫分析法或微生物法等測定方法檢測血液中某種有效成分的濃度，最后進行參數計算，分析其藥動學過程。曲靜偉等［8］利用熒光偏振免疫分析法指導臨床地高辛安全用藥。微生物法主要應用于具有抑菌作用的中藥復方，潘嘉等［9］以抑菌效應為測定指標，得出川芎揮發油藥動學過程屬于一室開放模型，為該復方抗炎有效成分組體內代謝研究奠定了基礎。

2．3．2 藥理效應法

藥理效應法是以藥理效應為測定指標計算藥動學參數的方法。本方法優點是檢測的藥理效應與中藥功能主治一致，可以計算藥物整體藥效動力學參數，符合中藥復方的整體觀念。五子衍宗方是經典的中藥復方，具有補腎益精、疏利腎氣的作用，王學美等［10-11］在此方面做了大量臨床研究，發現此方不僅可改善內分泌生殖系統，還可降低AchE 活性，減少線粒體DNA 氧化損傷，改善輕度認知障礙。這些研究不僅確定了該復方有效成分組的藥理效應，還為該方以后進一步的研究明確了方向。廖子君等［12］研究了中藥大黃的有效成分組中的大黃素，發現大黃素可顯著抑制人肺腺癌A-549 細胞的生長，使細胞周期阻滯在G0/G1期，并且具有濃度依賴性。

藥理效應法也有其局限性，由于中藥復方多靶點作用的機理，實驗過程中觀測指標不同所得的藥動學參數差異較大，再受到技術條件的限制，所得結論具有表觀性。動物實驗研究中還存在種屬差異等問題。

2．3．3 毒理效應法

毒理效應法又稱藥物累積法，是以血藥濃度多點測定的檢測方法，用動物急性死亡率代表藥物蓄積性的一種藥代動力學研究方法，主要適用于有效成分和毒性成分相一致的中藥。具體操作方法是多組動物按照不同的時間間隔給藥，求出不同時間點的體存百分率，再計算出藥動學參數。肖鳳霞等［13］用此方法測定出四逆注射劑的毒性效應在大鼠體內成一級動力學過程。毒理效應法操作簡單，檢測指標明確，但是不能應用于人體，所以不是中藥藥動學的發展方向。

2．3．4 血清藥理學(腦脊液藥理學)

血清藥理學研究方法是給動物經消化道服用一定劑量的藥物，在合適的時間采血，制備含藥血清，以含藥血清取代原藥或原藥粗提取物作為藥物源進行體外試驗的藥理學研究方法。由于是體外試驗，條件可控性強，可在細胞、亞細胞水平上檢測藥物效應和作用機理。血清為藥物源可避免粗制劑中的雜質或鞣質對體外細胞生存環境的影響，對中藥復方的研究有進步意義。王寧寧等［14］用體外試驗的方法，觀察含藥血清對癲癇大鼠離體海馬腦片的影響，揭示了中藥復方有效成分組的抗癲癇作用。王文萍等［15］用血清藥理學方法研究了中藥腸安泰體外對Co26lu 大腸癌細胞的抗癌作用。

隨著中藥血清藥理學的發展和中樞神經系統疾病防治的需要，中藥復方的有效成分能否穿過血腦屏障并發揮對神經系統的保護作用等問題越來越受到關注，中藥腦脊液藥理學應運而生。曾克武等［16］利用加味五子衍宗方含藥腦脊液研究了β 淀粉樣蛋白誘導海馬神經元損傷的保護作用，得出復方中的黃酮類和多糖類成分可透過血腦屏障進入腦脊液，并對神經損傷有一定的保護作用。陳艷艷等［17］以腦脊液藥理學為指導進行研究，發現芳香開竅類中藥石菖蒲可能會降低星形膠質細胞水通道-4 基因的表達。腦脊液藥理學為復方有效成分組的研究開辟了一條新的途徑。

但是，中藥血清藥理學實驗方法尚處在一種探索發展階段，其理論和實驗操作方面都存在問題有待進一步解決。首先被吸收入血的成分并不一定是有效成分，還可以是無效成分，甚至是毒性成分，所以不能確定含藥血清中發揮作用的就是有效成分。其次血清內源性成分復雜，再加上藥物被吸收后某些微量成分與蛋白結合，給藥物監測和藥理實驗帶來了困難。在實驗選材上，有待于規范動物的年齡和種屬，不同年齡和種屬的動物對藥物的吸收有差異，血清的藥物成分和含量也不盡相同。在實驗操作上，要把握好給藥劑量和采血時間［18］。

2．4 高通量藥物篩選技術

高通量篩選技術是20 世紀80 年代后期發展起來的用于新藥研發的高新技術。高通量篩選可在分子水平和細胞水平的基礎上通過自動化和計算機控制系統，同時對大量被篩選樣品進行生物學和藥理學活性評價。利用高通量藥物篩選技術分析復方有效成分組的思路是:首先利用天然產物快速分離技術將中藥復方分離成接近單體化合物水平的幾百個甚至更多的成分，將經過分離的這些樣品通過高通量篩選的多種藥物篩選模型便可以很快的了解各部分的藥效。再用現代色譜和色譜質譜聯用技術，找出復方的有效成分，采用成方組合的方式進行組合，形成有效成分組。最后用整體動物模型作藥理作用評價和理論分析［19］。王月華等［20］用高通量篩選技術對中藥復方小續命湯的240 個連續組分的生物活性進行研究，結果發現L1 ～L40 和A100 ～A120 連續組分的抗氧化、抗損傷的作用效果好，可將這兩部分重新組合作為小續命湯的有效成分組，對復方進行了精簡優化。高通量藥物篩選有可能得到治療效果更佳的理想藥物組分，為新藥研發提供思路。張冉等［21］建立α-葡萄糖苷酶抑制劑的高通量篩選模型，對30 味常用的清熱解表藥共72 個樣本進行篩選，發現鴨跖草、山慈菇和桑葉的提取物可抑制α-葡萄糖苷酶，具有降血糖作用。

高通量篩選技術的應用克服了中藥復方傳統研究方法的技術障礙，實現了藥物篩選的自動化和規模化。但是此項技術在國內起步較晚，尚處于發展階段。體外模型的篩選結果與整體藥理作用的關系，高通量篩選模型的評價標準以及新的藥物作用靶點的研究和發現等問題還有待進一步解決。

2．5 其他方法

膜分離技術在制藥工業中應用廣泛，可有效去除懸浮物、蛋白、色素等大分子雜質，在中藥的制備方面可取代醇沉，提取分離有效成分，特別是在提高中藥復方口服液質量方面更突顯其優勢［22］。近幾年，國內外越來越關注胃腸道環境對藥物的最初影響，研究發現中藥復方在胃腸道內的動態變化會影響有效成分的溶出，吸收和代謝。甘草酸是芍藥甘草湯中的有效配糖體成分之一，胃腸道菌群可將甘草酸代謝成活性產物甘草次酸，如果在臨床合用抗菌劑的話，會影響甘草酸的轉化，降低其生物利用度，何菊秀等［23］在此方面做出研究，指導臨床用藥。近年來不少研究發現中藥的作用原理與其生物活性成分調控基因表達有關。劉小美等［24］研究2 型糖尿病大鼠胰島素受體底物-2 基因表達及復方黃連降糖片對其的干預作用，發現其降糖原理可能與提高外周組織IRS-2 的基因表達，改善胰島素信號傳遞有關。類似的研究還有安胎養血合劑干預腎移植大鼠腎小管上皮細胞凋亡及Fas/FasL 基因的表達［25］，益氣扶正藥干預脾虛大鼠腦內IL-18 蛋白及基因表達等［26］。

中藥復方有效成分組研究方法優缺點比較見表1。

3 展望

中藥復方有效成分組的研究已經取得了較大的進展，但是其研究方法尚有待進一步的改進和提高，特別是以復方藥理作用機制為導向的有效成分組研究將是今后研究的重點。文中所述的各種中藥復方有效成分組研究方法各有利弊，如果能取長補短，再加上各學科之間的交叉滲透，可以開創一個中醫藥研究和現代化的新模式，有助于促進民族藥物的有效成分，作用機理和組方原理的闡明，并對中藥復方的臨床療效和質量控制提供有益的借鑒，這將在中國新型藥物研發過程中發揮重要作用。

表1 中藥復方有效成分組研究方法

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［3］ 劉斌，石任兵．苦參湯中生物堿部位的化學成分［J］．中國中藥雜志，2006，31(7):557-560．

［4］ 劉明生，郭小明，張俊清，等．復方腸胃康中黃酮類成分的研究［J］．世界科學技術-中醫藥現代化，2010，12(5):811-813．

［5］ 朱精英，魏麗萍，吳春敏．中藥指紋圖譜的研究進展［J］．海峽藥學，2011，23(4):5-8．

［6］ 郭秋平，高英，李衛民．中藥百合HPLC 指紋圖譜研究［J］．中成藥，2011，33(8):1280-1285．

［7］ 陳永剛，林勵．柑橘屬常用中藥黃酮類成分HPLC 指紋圖譜研究與比較［J］．中國中藥雜志，2011，36(19):2660-2665．

［8］ 曲靜偉，董文雅，洪中立，等．地高辛的血清濃度監測和劑量探討［J］．現代實用醫學，2005，17(9):560-562．

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［13］ 肖鳳霞，周莉玲，李銳．藥物累積法測定四逆湯制劑的藥動學參數［J］．時珍國醫國藥，2006，17(2):228-229．

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