Notch1胞內(nèi)段在鼻咽癌組織及鼻咽癌細(xì)胞株中的表達(dá)研究

張芳婷，萬匯涓，李明華，劉曉翌，尹美珺，葉 靜，于 潔

Notch信號(hào)通路作為經(jīng)典的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在一系列生理和病理過程中起著重要作用。近年來研究證實(shí)，Notch信號(hào)通路參與了鼻咽癌的發(fā)生過程，但至今機(jī)制仍不明確。探討其在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用將為發(fā)現(xiàn)鼻咽癌治療的新靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。由于非角化性鼻咽癌 (nonkeratin naspharyngeal carcinoma，NK-NPC)是鼻咽癌高發(fā)區(qū)的主要類型，因此本研究擬通過免疫組化染色與分子生物學(xué)技術(shù)研究Notch1在鼻咽癌中的表達(dá)。

1 材料與方法

1．1 材料 CNE1、CNE2鼻咽癌細(xì)胞株購自深圳欣海凌生物科技有限公司，SUNE-1、SUNE-1亞株5-8F、SUNE-1亞株6-10B及SUNE-1亞株9-4E鼻咽癌細(xì)胞株購自湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，52個(gè)NK-NPC標(biāo)本以及10例鼻黏膜炎癥標(biāo)本來源于北京大學(xué)深圳醫(yī)院耳鼻喉科，由北京大學(xué)深圳醫(yī)院病理科提供。

1．2 試劑 1640培養(yǎng)基 (GIBCO公司)、胎牛血清 (FBS，GIBCO公司)、磷酸鹽緩沖液 (PBS，GIBCO公司)、胰蛋白酶 (AMRESCO公司)、青鏈霉素(雙抗100×，Hyclone)、臺(tái)盼藍(lán) (SIGMA公司)。RNA提取試劑盒 (QIAGEN)，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Fermentas)，單克隆抗人Notch1 IC抗體 (RD)，即用型免疫組化Elivision TM super試劑盒 (邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司);RNA提取試劑盒 (Qiagen公司);RT-PCR試劑(Fermentas公司);DNA Maker I(Tiangen公司);人Notch1引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，上游引物5′-GCCGCCTTTGTGCTTCTGTTCTTC-3′，下游引物 5′-CCCGTGCGGTCTGTCTGGTTGTG-3′，產(chǎn)物長度為506 bp。內(nèi)參 β-actin擴(kuò)增片段大小204 bp，序列為F:GTGACGTGGACATCCGCAAAG，R:GGAGAATGGACAGCGAGGC。

1．3 方法

1．3．1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)法檢測 將各種鼻咽癌細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)至3代，收集細(xì)胞，TRIZOL抽提RNA;RT-PCR操作按說明書進(jìn)行，擴(kuò)增條件為:48℃ 45 min;94℃ 2min;94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán);72℃ 7 min，采用1．2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1．3．2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 常規(guī)制備細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，晾干后備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)先用過氧化物酶阻斷劑、非免疫血清各反應(yīng)10 min，甩棄多余液體后加抗人Notch1 IC抗體室溫孵育60 min。PBS洗后，加生物素標(biāo)記二抗10 min、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶10 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，逐級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下選取數(shù)個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，共計(jì)1 000個(gè)細(xì)胞。

1．3．3 免疫組化染色 常規(guī)石蠟切片，切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水至水化，雙蒸水洗5 min，3%H2O2甲醇液滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，微波熱修復(fù)95℃20min，自然冷卻。蒸餾水洗5 min，PBS洗10 min，滴加山羊血清封閉，室溫10 min;滴加一抗，室溫1 h或4℃過夜，PBS洗3次，5 min/次;滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫10 min，PBS洗3次，5 min/次;滴加過氧化物標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫10 min，PBS洗3次，5 min/次;滴加DAB顯色劑，鏡下控制，蒸餾水終止顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片。

1．3．4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化染色可定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。每張切片均于400倍光鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野1 000個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)＜20%為陰性，≥20%為陽性。

1．3．5 病理學(xué)檢測 常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟組織細(xì)胞和形態(tài)學(xué)變化。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用Personχ2檢驗(yàn)和確切概率法。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 RT-PCR檢測 經(jīng)RT-PCR后，瓊脂糖凝膠電泳顯示了不同鼻咽癌細(xì)胞株中Notch1基因的表達(dá)情況，可見各組細(xì)胞在506 bp的位置均出現(xiàn)產(chǎn)物帶，其中以CNE1表達(dá)最強(qiáng)，其他細(xì)胞株表達(dá)較弱 (見圖1)。

2．2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 制備細(xì)胞爬片，免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示:人Notch1胞內(nèi)段 (NIC)在CNE1細(xì)胞株中有陽性表達(dá)，在其他細(xì)胞株中幾無表達(dá) (見圖2)。

2．3 免疫組化染色 在未分化型鼻咽癌中，癌巢內(nèi)無陽性表達(dá)，周圍淋巴細(xì)胞陽性表達(dá);在分化型鼻咽癌中，癌細(xì)胞陽性表達(dá)明顯，而在鼻咽慢性黏膜炎癥組織幾乎未見陽性表達(dá)。NIC陽性染色為棕色，陽性表達(dá)位置不固定，可見于胞膜、胞核，或彌漫表達(dá)于胞質(zhì)中。在未分化型鼻咽癌中定位于核內(nèi)陽性細(xì)胞較分化型鼻咽癌多 (見圖2)。在未分化型鼻咽癌中可見數(shù)量不等的淋巴細(xì)胞浸潤。病理學(xué)染色及免疫組化染色結(jié)果對(duì)比顯示:癌巢本身Notch1染色呈陰性表達(dá)，而癌巢內(nèi)浸潤的淋巴細(xì)胞則表達(dá)陽性。

2．4 鼻咽癌組織中NIC的表達(dá)高于鼻咽慢性黏膜炎癥組織(χ2=7．8，P=0．005)。對(duì)所有鼻咽癌臨床標(biāo)本進(jìn)行性別、年齡、組織學(xué)分型方面的統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)NIC的表達(dá)在不同年齡、性別患者中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0．05);而在未分化型和分化型鼻咽癌中，NIC的陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0．05，見表 1)。

3 討論

Notch信號(hào)通路由受體、配體和CSL DNA結(jié)合蛋白3部分組成。其經(jīng)典作用路徑為:當(dāng)Notch受體受到配體的刺激后，身為跨膜受體蛋白的Notch分子由細(xì)胞膜上的蛋白酶復(fù)合物催化發(fā)生蛋白裂解，使NIC從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)釋放并進(jìn)入核內(nèi)。進(jìn)入核內(nèi)的胞內(nèi)段與轉(zhuǎn)錄因子RBP-J相互作用，激活含有RBP-J識(shí)別位點(diǎn)的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞分化相關(guān)基因如Hes家族分子的表達(dá)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化［1］。

圖1 鼻咽癌細(xì)胞株中人Notch1基因的表達(dá)Figure 1 Electrophoretogram of Notch1 mRNA RT-PCR product

圖2 人Notch1胞內(nèi)段在鼻咽癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)Figure 2 Expression of Notch1 intracellular domain in NK-NP C

表1 NIC在鼻咽癌中的表達(dá)情況Table 1 Expression of NIC in the NPC

Notch信號(hào)通路參與了鼻咽癌的發(fā)生過程，但至今機(jī)制仍不明確。病因?qū)W研究顯示:鼻咽癌的發(fā)生與EBV感染密切相關(guān)。EBV感染的B淋巴細(xì)胞永生化依賴于EB病毒核心抗原2(EBNA2)。EBNA2通過與Notch通路的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子RBP-J結(jié)合以活化c-myc、CD21、CD23、STAT6等基因，從而達(dá)到調(diào)控EBV對(duì)B淋巴細(xì)胞感染的過程［2］。因此，目前有推測認(rèn)為:這一感染途徑可能的機(jī)制是，上皮細(xì)胞與EBV陽性B淋巴細(xì)胞緊密接觸進(jìn)而引發(fā)上皮細(xì)胞感染［3］。

在哺乳動(dòng)物的4種Notch受體 (Notch1～4)中，Notch1與腫瘤的關(guān)系最為密切［4-5］，因此，本研究選擇具有活性的NIC以研究其在鼻咽癌中的表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示，在不同分化程度鼻咽癌細(xì)胞、組織中NIC表達(dá)有所差異，與患者年齡、性別無相關(guān)性，而與細(xì)胞分化程度相關(guān)，呈現(xiàn)分化程度越低表達(dá)量越低的趨勢。從慢性炎癥組織到分化型鼻咽癌，再到未分化型鼻咽癌，NIC的表達(dá)量逐漸增加，其定位由胞質(zhì)至胞核，而未分化型鼻咽癌NIC主要表達(dá)于侵入癌巢的淋巴細(xì)胞上，提示Notch1在鼻咽癌發(fā)生中有促進(jìn)作用，其作用途徑可能與淋巴細(xì)胞侵潤相關(guān)。這一結(jié)果符合有關(guān)EBV感染鼻黏膜上皮細(xì)胞機(jī)制的推斷，也與Wang等［6］的研究結(jié)果基本一致，而Notch1受體活化途徑和EB病毒感染途徑是否一致，還有待進(jìn)行深入探討和研究。

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3 Zong YS，Zhong BL，Liang YJ，et al．Advancement of studying the biological characteristics of nasopharyngeal carcinogenesis［J］．Ai Zheng，2002，21(6):686-695．

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5 Nicolas M，Wolfer A，Raj K，et al．Notch1 functions as a tumor suppressor in mouse skin ［J］．Nature Genet，2003，33(3):416-421．

6 Wang M，Li JT，Zeng YX，et al．Expression and Significance of Notch1，P21WAF1 and involucrin in nasopharyngeal carcinoma［J］．Ai Zheng，2005，24(10):1230-1234．