轉化生長因子β1和Smad4蛋白在肝癌組織中的表達及其意義

馬洪波，黃 濤，韓 風，陳偉瑜

我國約有90%的肝癌患者具有乙型肝炎背景，部分患者存在丙型肝炎病毒 (HCV)、乙型肝炎病毒 (HBV)以及丁型肝炎病毒 (HDV)的重疊感染，其在經過長期的慢性炎癥后可逐漸演變為肝硬化等。現代分子生物學研究發現，轉化生長因子β1－抑癌基因 (TGF－β1－Smad)信號通路在肝纖維化、肝炎、肝硬化過程中扮演著重要角色，是目前分子生物學研究的熱點之一［1］。Smad4蛋白由DPC4基因編碼，是一類對TGF－β1信號起轉導作用的胞質信號級聯效應分子，具有受體激活型效應的Smad(R－Smad)受到信號刺激后會發生磷酸化，導致蛋白自身的構象發生變化并與同型的Smad4蛋白相互結合而形成寡聚體，寡聚體轉位入核之后則參與調控很多靶基因的表達，發揮TGF－β1－Smad信號通路的調控效應;而抑制型的Smad(I－Smad)也必須和Smad4蛋白進行相互作用后才可抑制TGF－β1信號向下一級傳遞［2－3］。DPC4基因所編碼的蛋白即Smad4蛋白對整個TGF－β1－Smad信號轉導途徑起關鍵作用，該基因的表達異常會引發細胞無限增殖的現象，研究TGF－β1與Smad4蛋白在肝癌組織中的表達具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年3月—2011年4月我院收治的肝癌患者54例，其中男31例，女23例，年齡24～67歲，平均44.9歲。腫瘤分期:Ⅰ期14例，無顯著肝癌癥狀和體征;Ⅲ期19例，有腹腔積液、黃疸、遠處轉移、惡液質癥狀之一;Ⅱ期21例，癥狀介于Ⅰ期與Ⅲ期之間。患者的肝癌組織均在術后冷凍保存備用;同時選取患者的癌旁組織分別編號冷凍后備用。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 濃縮型兔抗人TGF－β1和Smad4蛋白單克隆抗體均購自Sigema公司，工作濃度為1∶200。原位雜交檢測試劑盒、二氨基聯苯胺 (DAB)試劑盒、鏈霉親和素－過氧化復合物 (ABC)等購自羅氏公司。

1.2.2 實驗方案 采用原位雜交顯色法 (IHCABC法)，TGF－β1以及Smad4一抗工作濃度均為1∶200，行DAB顯色及常規原位雜交 (ISH)。以磷酸鹽緩沖液 (PBS)為陰性對照，以有淋巴結轉移的癌組織作為陽性對照。蛋白質原位雜交與RNA原位雜交按照《分子克隆實驗指南》［4］進行。對肝癌組織及癌旁組織Smad4 mRNA和Smad4蛋白表達量進行分析，確定肝癌組織及癌旁組織中DPC4基因在轉錄和翻譯水平上是否存在差異，即Smad4 mRNA和Smad4蛋白的差異。若存在差異 (已經預實驗證實)，則進一步探討Smad4蛋白與TGF－β1的相關性，尋找二者的關系。

1.3 結果判定 在400倍光鏡下隨機選取8個視野進行拍照，胞質及胞膜上出現棕黃色顆粒為陽性，陽性細胞的結構必須清晰，著色明顯且定位準確，計算陽性染色面積所占比例，陽性細胞面積占總面積的80%及以上計4分;占總面積的50%～79%計3分;占總面積的10%～49%計2分;小于總面積的10%計1分;不著色為陰性，計0分。同時進行光密度半定量分析，并求得其平均值，按陽性信號的強度計分，陰性計0分，弱陽性計2～3分，中度陽性計4～5分，強陽性計6～7分。陽性面積評分和信號強度評分的乘積為總分，總分≤5分為低表達，＞5分為高表達。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統計學處理，計量資料以 (±s)表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌組織及癌旁組織中Smad4蛋白及Smad4 mRNA的表達和半定量結果 Smad4蛋白在肝癌組織中高表達21例，高表達率為38.9%;癌旁組織中高表達25例，高表達率為46.3%，兩種組織中Smad4蛋白高表達率比較，差異有統計學意義 (χ2=16.59，P=0.01);Smad4 mRNA在肝癌組織中高表達28例，高表達率為51.9%;癌旁組織中高表達36例，高表達率為66.7%，兩種組織中Smad4 mRNA高表達率比較，差異有統計學意義 (χ2=7.83，P=0.01)。肝癌組織中Smad4蛋白陽性面積與癌旁組織比較，差異無統計學意義 (P＞0.05)，光密度值比較，差異有統計學意義 (P＜0.05);肝癌組織中Smad4 mRNA陽性面積和光密度值與癌旁組織比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見表1)。

表1 肝癌組織及癌旁組織中Smad4蛋白及Smad4 mRNA的表達和半定量結果 (±s，n=54)Table 1 The expression and semi－quantitative results of Smad4 gene and Smad4 mRNA in HCC tissues and adjacent noncancerous tissues

表1 肝癌組織及癌旁組織中Smad4蛋白及Smad4 mRNA的表達和半定量結果 (±s，n=54)Table 1 The expression and semi－quantitative results of Smad4 gene and Smad4 mRNA in HCC tissues and adjacent noncancerous tissues

組織類型 陽性面積 (μm2)Smad4蛋白Smad4 mRNA肝癌組織 32.93±17.62 26.53±13.51 0.11±0.01 0.17±0.01 Smad4 mRNA光密度Smad4蛋白癌旁組織 33.14±15.97 45.12±15.27 0.22±0.01 0.26±0.01 t 0.97 17.93 9.71 11.64 P值值0.62 0.01 0.02 0.01

2.2 肝癌組織中TGF－β1表達和Smad4蛋白表達與臨床病理特征的關系 肝癌組織中TGF－β1和Smad4蛋白高表達率在男女間，差異均無統計學意義 (P＞0.05);以45歲為界，肝癌組織中TGF－β1和Smad4蛋白高表達率在不同年齡間比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05);在不同病理分期間比較，差異亦均有統計學意義 (P＜0.05)，且隨著病理分期增加，TGF－β1和Smad4蛋白高表達率明顯升高 (見表2)。

表2 肝癌組織中TGF－β1表達和Smad4蛋白表達與病理特征的關系〔n(%)，n=54〕Table 2 Relationship between the expression of TGF－β1and Smad4 protein in HCC tissues and clinical pathological features

3 討論

腫瘤的發生發展是多因素、多基因表達共同變化的過程，主要與癌基因的激活及抑癌基因的失活或受抑制有關，細胞增殖和細胞信號轉導途徑在其中扮演著重要角色［5－6］。TGF－β1對細胞的調控機制非常復雜，主要通過多條信號轉導通路來完成，在這些信號轉導通路中有TGF－β1以及相關受體蛋白尤其是Smad蛋白家族參與。這些作用分子的功能及狀態影響著細胞對生長調節信號的傳導、應答及反饋。TGF－β1參與細胞的多種基因調控，是很多與腫瘤組織生長有關的負調節因子，在人體細胞分化以及惡性腫瘤行為中具有重要作用。DPC4基因是在上個世紀由Hongmei等［7］發現的新型抑癌基因，是TGF－β1－Smad信號通路的關鍵轉錄因子，可看做是一個中心分子。而Smad 4蛋白能夠與Smad家族成員的任意一種發生相互作用，一旦DPC4基因發生缺失、突變或沉默，將導致其功能喪失，進而導致整個信號通路甚至整個細胞代謝發生紊亂，最終形成腫瘤［8］。受 DPC4基因調控的下游基因有 p21、TSP1等。p21是細胞周期蛋白依賴性激酶的抑制物，能夠抑制CDK與細胞周期蛋白形成復合物，并使細胞生長停留在G1期，進而調控細胞的分裂增殖。其他下游基因主要調控一些細胞的增殖分化、凋亡以及血管生成。胃癌、胰腺癌、乳腺癌等均與DPC4基因的缺失和突變有關，TGF－β1－Smad信號通路對于腫瘤的發生發展極其重要［10－12］。

本研究結果顯示，肝癌組織中Smad4蛋白高表達率和半定量結果均低于癌旁組織，說明肝癌細胞內部DPC4基因呈低表達甚至不表達，使得TGF－β1－Smad信號通路受阻，進而導致機體對肝癌細胞的分裂、分化和增殖失去控制。如果肝癌細胞能重新正常表達DPC4基因，可能會有效地抑制肝癌的進一步發展。肝癌組織中TGF－β1和Smad4蛋白高表達與患者性別無關，而與病理分期和年齡增長 (≥45歲)有關。但本研究樣本例數有限，所采用的方法本身存在一定的局限性，只能揭示Smad4蛋白在肝癌組織和癌旁組織的表達特征，要想得到Smad4蛋白與肝癌發生關系的直接證據，需構建DPC4基因表達載體，進一步研究其在肝癌組織中的病理變化，深入探討TGF－β1和Smad4蛋白的作用。

1 Samarakoon R，Chitnis SS，Higgins SP，et al.Redox－ induced Src kinase and caveolin－1 signaling in TGF－β1－initiated SMAD 2/3 activation and PAI－ 1 expression ［J］.PLoS One，2011，6(7):e22896.

2 Wang QL，Tao YY，Yuan JL，et al.Salvianolic acid B prevents epithelial－to－mesenchymal transition through the TGF－beta1signal transduction pathway in vivo and in vitro ［J］.BMC Cell Biol，2010，11:31.

3 Mickey M，Martin，Jessica A，et al.Elton TGF － β1stimulates human AT1 receptor expression in lung fibroblasts by cross talk between the Smad，p38 MAPK，JNK，and PI3K signaling pathways［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，293(3):L790 －L799.

4 黃培堂譯.分子克隆實驗指南 (上下冊) ［M］.科學出版社，2005:1012－1633.

5 Piyali Mukherjee，Sherry L，Winter，et al.Cell cycle arrest by transforming growth factor β1near G1/S is mediated by acute abrogation of prereplication complex activation involving an Rb－MCM interaction［J］.Mol Cell Biol，2010，30(3):845 －856.6 Huang WC，Yen FC，Shie FS，et al.TGF －β1blockade of microglial chemotaxis toward Aβ aggregates involves SMAD signaling and downregulation of CCL5 ［J］.J Neuroinflammation，2010，7:28.

7 Hongmei Peng，Oscar A，Carretero，et al.Ac－ SDKP inhibits transforming growth factor－β1－induced differentiation of human cardiac fibroblasts into myofibroblasts ［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，298(5):H1357－H1364.

8 陳國平，夏立平.TGF－β/Smads信號轉導途徑與腫瘤的關系［J］.海南醫學院學報，2009，15(1):91.

9 夏立平，劉曉力，陳國平，等.TGF－β1、TGF－βR1、Smad4在乳腺癌發生、發展中的作用及其相互關系［J］.海南醫學院學報，2010，16(6):693－698.

10 丁平，宋炳紅，朱利敏，等.TGF－β/Smad4基因信號通路對結直腸癌腫瘤細胞株轉移潛能影響的研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2011，18(19):1519－1521.

11 程朋，曾維政，蘇曉妹，等.TGFβ1與Smad4基因在肝細胞癌中的表達及意義 ［J］.臨床腫瘤學雜志，2009，14(7):609－613.

12 陳桂敏，王少賢.肝纖維化TGF－β1/smad信號通路中醫藥研究進展［J］.海南醫學院學報，2010，16(6):810－812.