扶正肺瘤方對(duì)黑色素瘤B16體內(nèi)抑制作用的研究

歐陽(yáng)郴生，趙 霞，古宏暉，楊麗娜，陳 鐘，汪桃利

(深圳市中醫(yī)院 腫瘤科，廣東 深圳 518033)

扶正肺瘤方是我科臨床長(zhǎng)期運(yùn)用的治療肺癌的中藥復(fù)方，具有一定的臨床療效，為進(jìn)一步研究其確切作用，我們通過(guò)建立BALB/C無(wú)胸腺裸小鼠黑色素瘤B16模型,觀察扶正肺瘤方對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用，研究如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物 BALB/C無(wú)胸腺裸小鼠，體質(zhì)量18～20 g，4～5周齡，清潔級(jí)，36只，雌雄各半，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所提供，飼養(yǎng)環(huán)境為無(wú)特殊病原體條件(SPF)。

1.2 瘤株 黑色素瘤B16，購(gòu)自中山醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所。

1.3 供試品 扶正肺瘤方，由本院制劑室提供，用生理鹽水配制成不同濃度藥液,2～8 ℃冷藏備用。

1.4 試劑 福爾馬林液、雙抗(鏈霉素100 μg/mL，青霉素100 U/mL)，胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶，D-Hanks液、谷氨酰胺，RPMI1640培養(yǎng)基。

1.5 實(shí)驗(yàn)器材 游標(biāo)卡尺，哈爾濱北量螺紋量規(guī)工具制造廠；電子天平，BS22型，德國(guó)賽多利斯；倒置顯微鏡，CKX31型，Olympus公司；CO2培養(yǎng)箱，2406-2型,美國(guó)Sheldon公司。

2 方法

2.1 黑色素瘤B16細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[1]方法，B16黑色素瘤瘤株在10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基(含雙抗)，37 ℃，5%CO2環(huán)境中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，D-Hank液洗滌2次，臺(tái)盼藍(lán)染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)存活腫瘤細(xì)胞，存活腫瘤細(xì)胞應(yīng)大于95%。調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/mL。

2.2 建立黑色素瘤B16動(dòng)物模型 消毒BALB/C裸小鼠右側(cè)腋窩皮膚，注射黑色瘤B16細(xì)胞懸液，0.2 mL/只。

2.3 分組與給藥 采用隨機(jī)分組方法，將36只裸小鼠分為3組,每組12只。分別為扶正肺瘤方低劑量(18g/kg體質(zhì)量)、高劑量(36g/kg體質(zhì)量)組和模型對(duì)照組。于移植腫瘤當(dāng)日始，低劑量組和高劑量組分別給予相應(yīng)劑量扶正肺瘤方藥液，模型對(duì)照組給予等體積生理鹽水。給藥途徑為經(jīng)胃腸給藥，每日1次，每次0.5 mL，連續(xù)給藥21 d。

2.4 采集標(biāo)本 第21天處死動(dòng)物，剝離腋下腫瘤組織，采集脾臟和肺臟，分別稱重。

2.5 觀察指標(biāo)與方法[2]

2.5.1 一般情況觀察 每天記錄飼料及飲用水的消耗量并觀察裸小鼠的精神和活動(dòng)情況。

2.5.2 腫瘤轉(zhuǎn)移情況 用福爾馬林固定肺臟，解剖鏡下觀察并計(jì)數(shù)兩肺的腫瘤轉(zhuǎn)移灶(結(jié)節(jié))，病理組織學(xué)檢查證實(shí)結(jié)節(jié)由黑色素瘤細(xì)胞構(gòu)成。

2.5.3 脾指數(shù) 脾指數(shù)=脾重(mg)/體質(zhì)量(10 g)。

2.5.4 抑瘤率 抑瘤率%=(1-T/C)×100%，T/C為實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組平均瘤重。

2.5.5 腫瘤平均直徑倍增時(shí)間(MDDT) 從接種腫瘤后第6天起，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的3個(gè)相互垂直的直徑，取平均值，即為平均直徑(MD)。隔日測(cè)量1次，觀察MD達(dá)到起始值2倍的時(shí)間，即腫瘤平均直徑倍增時(shí)間(MDDT)。

2.5.6 肺轉(zhuǎn)移抑制率 肺轉(zhuǎn)移抑制率=[(對(duì)照組肺轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)-實(shí)驗(yàn)組肺轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù))/對(duì)照組肺轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)]×100%。并觀察雙側(cè)腋窩淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移情況。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 接種黑色素瘤B16細(xì)胞后,動(dòng)物精神、活動(dòng)無(wú)明顯異常。給予扶正肺瘤方藥液后，動(dòng)物外觀、精神、活動(dòng)、飲食情況均無(wú)明顯異常變化。給藥2周后,對(duì)照組動(dòng)物普遍出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡，皮膚無(wú)光澤。扶正肺瘤方高、低劑量組小鼠于整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間外觀無(wú)明顯異常變化,精神、活動(dòng)、飲食均正常。給藥第17天對(duì)照組1只裸鼠因操作失誤導(dǎo)致灌胃時(shí)死亡，其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)中途死亡。

3.2 脾指數(shù) 見表1。

表1 B16黑色素瘤脾重、脾指數(shù)比較(±s)

3.3 腫瘤平均直徑倍增時(shí)間和抑瘤率 見表2。

表2 B16黑色素瘤腫瘤平均直徑倍增時(shí)間和抑瘤率(±s)

3.4 體質(zhì)量和肺重 見表3。

表3 B16黑色素瘤小鼠體質(zhì)量、肺重比較(±s)

3.5 肺轉(zhuǎn)移抑制率、肺內(nèi)轉(zhuǎn)移率和結(jié)節(jié)數(shù) 對(duì)照組肺部轉(zhuǎn)移率為100%，高劑量組的肺內(nèi)轉(zhuǎn)移率僅為66.67%，低劑量組的肺內(nèi)轉(zhuǎn)移率也僅為75.00%，見表4。

表4 B16黑色素瘤小鼠肺內(nèi)轉(zhuǎn)移率及肺內(nèi)結(jié)節(jié)數(shù)

3.6 各組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(平均重量)比較 見表5。

表5 B16黑色素瘤小鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(±s) mg

4 討論

通過(guò)建立BALB/C無(wú)胸腺裸小鼠黑色素瘤B16動(dòng)物模型,經(jīng)過(guò)21 d的灌胃給藥，給藥組均呈現(xiàn)不同程度MDDT延長(zhǎng)，腫瘤重量、肺重量減輕，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)及淋巴結(jié)重量減少，肺轉(zhuǎn)移率減少，脾指數(shù)增加，抑瘤率達(dá)43.94%。由此可見,扶正肺瘤方可有效提高裸小鼠免疫功能，抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

原發(fā)性支氣管肺癌是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤，也是臨床最常見的惡性腫瘤之一。近20年來(lái),其發(fā)病率和病死率在全部惡性腫瘤中上升幅度最大，已居首位[3]。肺癌可分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC占肺癌總數(shù)的80%以上。SCLC以全身化療為主,聯(lián)合放療和手術(shù)為主要治療手段；NSCLC則以外科手術(shù)結(jié)合術(shù)后放、化療為主。化療、放療對(duì)縮小瘤體有較肯定的療效，但其對(duì)骨髓、肝腎及免疫等功能的損傷較大，對(duì)人體造成明顯的毒副作用，降低患者生存質(zhì)量。中醫(yī)藥療法是我國(guó)肺癌治療的特色，應(yīng)用中藥配合放化療較單純放化療治療肺癌具有明顯優(yōu)勢(shì)[4-7]。

扶正肺瘤方是我科在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，總結(jié)多年臨床研究經(jīng)驗(yàn)，并經(jīng)前期反復(fù)實(shí)踐摸索，長(zhǎng)期運(yùn)用于臨床治療肺癌的中藥復(fù)方。臨床表明，應(yīng)用扶正肺瘤方聯(lián)合化療可以改善肺癌患者臨床癥狀，減輕化療的毒副反應(yīng)，提高生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期。為了進(jìn)一步研究扶正肺瘤方對(duì)肺癌的治療效果，探究藥物作用機(jī)制,我們通過(guò)建立裸小鼠黑色素瘤B16模型來(lái)觀察研究扶正肺瘤方對(duì)腫瘤的作用。

裸小鼠黑色素瘤B16模型是比較成熟的腫瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚8]，在本實(shí)驗(yàn)中，造模全部成功，同側(cè)、對(duì)側(cè)腋窩淋巴結(jié)均出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，且對(duì)照組肺部轉(zhuǎn)移率為100%。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，扶正肺瘤方能抑制黑色素瘤B16在BALB/C裸小鼠腋下種植局部的生長(zhǎng),給藥組腫瘤MDDT及瘤重均較對(duì)照組減小，高劑量組抑瘤率達(dá)到43.94%。MDDT為腫瘤平均直徑(MD)達(dá)到起始值2倍的時(shí)間，反映腫瘤的增殖速度，倍增時(shí)間越長(zhǎng)，說(shuō)明腫瘤的生長(zhǎng)越緩慢。說(shuō)明了扶正肺瘤方能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。給藥組脾指數(shù)增加，肺內(nèi)轉(zhuǎn)移率減少，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)減少，同側(cè)及對(duì)側(cè)腋窩淋巴結(jié)重量較對(duì)照組減輕，說(shuō)明扶正肺瘤方能提高免疫功能，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移起抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)證明扶正肺瘤方對(duì)黑色素瘤B16模型有一定的抑瘤、抗轉(zhuǎn)移作用,本次實(shí)驗(yàn)的研究?jī)?nèi)容對(duì)進(jìn)一步探索扶正肺瘤方抑制腫瘤的作用機(jī)制具有積極的意義。

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