蘇木乙酸乙酯提取物對大鼠心臟移植慢性排斥模型血清IL-4的影響

劉 穎，周亞濱

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)二科，黑龍江 哈爾濱 150040)

白細胞介素4(IL-4)是由Th2分化出來的細胞因子,Th1和Th2均來自相同的Th細胞前體，在抗原遞呈階段，受環(huán)境和遺傳因素的影響而分化成不同的細胞。在移植物的長期存活中，體內(nèi)細胞因子的產(chǎn)生具有重要意義。為此本實驗應(yīng)用大鼠腹腔異位心臟移植模型，檢測蘇木乙酸乙酯提取物對大鼠心臟移植后血清中IL-4水平的影響,探討蘇木乙酸乙酯提取物在心臟移植后對機體的免疫抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性，清潔級近交系大鼠，供者Wistar大鼠，體質(zhì)量150～200 g；受者SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g。均購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗動物中心。實驗動物在通風(fēng)、溫度、濕度適宜的動物室內(nèi)飼養(yǎng)。動物合格證號：2008001XYXK。

1.2 實驗藥物 環(huán)孢素A：將環(huán)孢素膠囊(華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，每粒含CsA 25 mg)溶于橄欖油中,稀釋至3.5 mg/mL濃度，室溫保存?zhèn)溆谩ＬK木乙酸乙酯提取物:蘇木，購自黑龍江省藥材公司，產(chǎn)地云南，經(jīng)生藥鑒定。將蘇木粗粉(40目)用75%乙醇浸泡4 h，加熱至85 ℃，連續(xù)回流提取2 h，過濾；反復(fù)2次，將濾液合并，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中水浴蒸干，轉(zhuǎn)入真空干燥箱中烘干至恒重，制成乙醇提取干粉。將乙醇提取干粉加入雙蒸水混懸，用乙酸乙酯卒取，回收溶劑得到乙酸乙酯提取物。溶于橄欖油中，配制成含生藥量0.115 g/mL，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 心臟移植慢性排斥動物模型建立 大鼠同種異位心臟移植術(shù)，采用改良的Ono術(shù)式,以Wistar大鼠為供體、SD大鼠為受體，術(shù)后將2 h清醒能站立,手指稍用力即可觸及心臟跳動，且24 h內(nèi)不停跳者作為實驗動物模型，移植心臟存活時間以天為計算單位,手術(shù)當天按0天計算，不足24 h者采用四舍五入法計算，術(shù)后當天給予35 mg/(kg·d)CsA灌胃，并對大鼠進行編號,灌胃連續(xù)21 d，以抑制急性排斥反應(yīng)。隨機抽取存活的不同編號的大鼠3只，在光鏡下觀察移植物血管病理形態(tài)呈慢性排斥反應(yīng)改變，為慢性排斥反應(yīng)模型建立。

1.4 實驗分組及給藥 將連續(xù)灌服21 d CsA后成功存活的大鼠隨機分為3組，每組8只。第1組為環(huán)孢素A組(環(huán)孢素組)，術(shù)后24 h環(huán)孢素A橄欖油灌胃，按35 mg/(kg·d)給藥,連續(xù)給藥21 d后，予環(huán)孢素A橄欖油灌胃，12 mg/(kg·d)給藥，連續(xù)給藥7 d至排斥終末。第2組為蘇木乙酸乙醋提取物組(蘇木組)，術(shù)后24 h環(huán)孢素A橄欖油灌胃，35 mg/(kg·d)給藥，連續(xù)給藥21 d后，予蘇木乙酸乙醋提取物橄欖油灌胃，按含生藥量1.15 g/(kg·d)給藥,連續(xù)給藥7 d至排斥終末。第3組為對照組，術(shù)后24 h環(huán)孢素A橄欖油灌胃，按35 mg/(kg·d)給藥，連續(xù)給藥21 d后，予等體積橄欖油灌胃，連續(xù)給藥7 d至排斥終末。

1.5 標本的采集 術(shù)后28 d對大鼠行眼眶下靜脈采血，離心，取血清，-80 ℃冰箱內(nèi)冷藏，待做ELESA法檢測。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)成功率 正式實驗60例，成功29例，失敗31例，其中血管吻合口出血過多致死20例；建立慢性排斥反應(yīng)模型灌胃液體進入胸腔致死11例。成功率48.3%。

2.2 一般情況 術(shù)后大鼠多在2～4 h內(nèi)清醒，呼吸平穩(wěn),心臟搏動規(guī)則、有力。4 h左右可以進食、飲水。3～4 d后刀口愈合。建立慢性排斥反應(yīng)模型成功后，對照組一般情況及食欲較差，懶動，體毛疏松易脫落。環(huán)孢素組進食較少，皮毛無光澤。蘇木組一般情況逐日好轉(zhuǎn)，進食及活動量逐漸增加。

2.3 大鼠血清中IL-4的含量變化 見表1。

表1 各組大鼠血清IL-4水平的變化(±s)

3 討論

Th0在不同細胞因子作用下可以分化為Th1、Th2等細胞亞群，進而分泌不同的細胞因子,在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。Thl/Th2具有不同的生物學(xué)功能、分泌不同的細胞因子。分別在細胞免疫和體液免疫中發(fā)揮作用。T細胞大部分效應(yīng)功能是通過細胞因子來介導(dǎo)的。Thl分泌的細胞因子有IL-2、IFN-γ、TNF-α，以分泌IFN-γ為主，Ig表型為IgG2a；Th2分泌的細胞因子有IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13，以分泌IL-4為主,Ig表型為IgGl，IgE。

Thl參與CTL介導(dǎo)的細胞免疫；Th2促進抗體(IgGl與IgE)產(chǎn)生,參與體液免疫。同時Thl和Th2所分泌的細胞因子可相互作用:IFN-γ和IL-2可促進向Thl分化，并抑制Th2增殖；而IL-4、IL-10、IL-5、IL-6和IL-13可以促進向Th2分化,抑制Thl增殖和細胞免疫應(yīng)答。在正常情況下，Thl和Th2功能處于動態(tài)平衡，當機體受到外來抗原攻擊時，Thl和Th2中某一亞群功能增強，另一亞群功能減弱，該現(xiàn)象被稱為“克隆轉(zhuǎn)換”(clonaldiversion)。

接受器官移植的受者，當移植物發(fā)生排斥反應(yīng)時，IFN-γ和IL-2等細胞因子表達增高；IL-4和IL-10等不表達或低表達[1]。研究[2]證明Thl與急性排斥反應(yīng)有關(guān)；Th2與免疫耐受有關(guān)。移植免疫中通過細胞因子調(diào)節(jié)Thl/Th2分化及細胞因子表達有重要的臨床意義。Thl能輔助CD8+CTL前體激活,使之增殖為效應(yīng)性CD8+CTL；多種趨化性細胞因子可使活化的Thl遷移至移植物局部，發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)，從而引發(fā)急性排斥反應(yīng);而Th2主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，輔助抗體生成，使抗原特異的B細胞分泌IgGl和IgE抗體,與免疫耐受的誘導(dǎo)和維持有密切關(guān)系。

Saggi等[3]在大鼠同種異體腎移植的模型中發(fā)現(xiàn)，在組織病理正常時IL-4、IL-10的局部表達增高，在排斥反應(yīng)發(fā)生時IFN-γ表達才增高,因此認為，IL-4、IL-10的表達提示免疫耐受的產(chǎn)生,而IFN-γ的表達和IL-4的缺乏則提示急性排斥反應(yīng)。He等[4]在大鼠心臟移植研究中發(fā)現(xiàn)，利用大鼠重組rIL-4對移植受體進行腹腔注射可以顯著的延長移植物的存活時間。Shirwan等[5]在動物模型中發(fā)現(xiàn)長期存活的動物，血清IL-4和IL-10水平明顯升高，而在急性排斥中二者的水平很低。

本實驗結(jié)果表明，蘇木乙酸乙酯提取物可明顯升高大鼠血清IL-4水平,延長移植物的生存時間，減輕排斥反應(yīng)，可在一定程度上說明蘇木乙酸乙酯提取物具有一定的免疫抑制作用，是一種很有前途的心臟移植后免疫抑制劑。

[1]Sallusto F,Mackay CR,Lanzavecchia A.Selective expression of the eotaxin receptor CCR3 by human T helper-cells[J].Science,1997,277(5334):2005-2007.

[2]Field EH,Rouse TM,Gao Q,et al.A ssociation between enhanced Th2-Thl cytokine profile and donor T2 cell chimerism following total lymphoid irradiation[J].Hum Immunol,1997,52(2):144-154.

[3]Saggi BH,Fisher RA,Bu D,et al.Intrgraft cytokine expression and tolerance induction in rat renal allografls[J].Transplantation,1999,67:206-210.

[4]He XY,Chen J,Verma N,et al.Treatment with interleukin-4 prolongs allogenic neonatal heart graft survival by inducing T helper 2 responses[J].Transplantation,1998,65:1145.

[5]Shirwan H,Barwari L,Khan NS.Predominant expression of T helper 2 cytokines and altered expression of T helper 1 cytokine in long-term allograft survival induced byintrathymic immune modulation with donor class I major histocompatibility complex peptides[J].Transpl,1998,66(12):1802-1809.