基于雙向固體發酵技術的靈青菌質發酵動態變化研究

劉學湘，陳建偉，蘇 潔

(南京中醫藥大學中藥學一級學科，江蘇 南京 210046)

馬兜鈴科植物青木香(Radixaristolochiae)是中醫臨床常用的一種中藥。作為理氣藥，中醫認為它具有平肝止痛，解毒消腫的作用，用于眩暈頭痛，胸腹脹痛，癰腫疔瘡，蛇蟲咬傷。現代藥理[1-3]實驗證明具有抗炎、鎮痛、解痙、降壓和抗菌等多種活性。青木香所含毒性成分為馬兜鈴酸類(aristolochic acid，AA)物質，因“馬兜鈴酸腎毒性”導致2004年SFDA已取消了其藥用標準。鑒于此目前處方和制劑以土木香替代青木香，但文獻調研結果顯示土木香的植物來源、親緣關系、功效主治、化學成分、藥理作用和臨床應用等方面都與青木香有很大的差異[4],所以替代使用仍存在一定爭議。目前對于含AA成分的藥物減毒主要采取炮制[5]和中藥配伍[6]等手段。本研究出發點基于上世紀80年代后期莊毅研究員提出的藥用真菌“新型固體發酵工程”的理論。前期實驗根據真菌與發酵基質組合雙方的發酵情況，初步判定靈芝、紅栓菌、白僵菌、槐耳等13種真菌與青木香藥材基質基本相適應，組成13種發酵組合。本實驗研究的是靈芝菌與青木香的發酵組合產物靈青菌質中基質轉化率、總馬兜鈴酸和馬兜鈴酸Ⅰ的含量隨不同發酵時間的動態變化，為判定靈青菌質的發酵終點及其質量標準的制定提供了科學依據和實驗基礎。

1 實驗材料

LC-10AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；UV-2401 PC紫外可見分光光度儀(日本島津公司);立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50KB(上海申安醫療器械廠)；超凈工作臺403(江蘇無錫縣空氣凈化設備廠)；隔水式電熱培養箱PYX-DHS(上海醫療器械七廠);SYZ-A石英亞沸高純水蒸餾器(江蘇金壇國勝儀器廠)；AE240電子天平(METTLER公司)；202型電熱恒溫干燥箱(上海索普儀器有限公司);FW80型微型高速萬能試樣粉碎機(河北省黃驊市齊家務科學儀器廠)。

青木香藥材，購自南京鹿江中藥飲片廠，批號：20070728，經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定為馬兜鈴科植物馬兜鈴AristolochiadebilisSieb.etZucc.的干燥根；馬兜鈴酸Ⅰ對照品，購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110746-200305，供含量測定用；靈芝菌種由南京中醫藥大學藥用菌與中藥生物技術研究中心提供。

乙腈為色譜純，自制重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 PDA斜面培養基配制及其靈芝菌的活化 按以下配方常規配制PDA斜面培養基，配方：馬鈴薯200 g(去皮切塊)，葡萄糖20 g，瓊脂18～20 g，加水至1 000 mL,pH自然。無菌條件下將靈芝菌接種于PDA斜面上，27～28 ℃避光培養4 d，待靈芝菌白色菌絲長滿斜面,取出，置4 ℃冰箱保存，待用。

2.2 青木香基質的制備 將青木香粉碎，過10目篩，填裝干凈試管，加適量水濕潤，pH自然，混合均勻后，扎口，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻，待用。

2.3 固體發酵 從活化后的靈芝菌菌種斜面上切取一小塊菌絲連同培養基，轉入青木香基質表面，扎口，置(28±1)℃培養箱中，定期觀察并記錄菌絲體生長情況。

2.4 靈青菌質的處理 每隔1周從試管中掏出青木香的靈芝菌發酵產物,即靈青菌質，置烘箱內，60 ℃干燥，稱取菌質干重，計算基質轉化率(%)。基質轉化率(%)=菌質干重(g)/青木香基質干重(g)×100%。

2.5 HPLC法測定馬兜鈴酸Ⅰ含量

2.5.1 色譜條件 色譜柱為Water X Terra C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：乙腈-1%醋酸水溶液(51∶49)，流速:1.0 mL/min；檢測波長：315 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。該條件下對照品峰與樣品中其他色譜峰基本達到基線分離。

2.5.2 對照品溶液的制備 精密稱取馬兜鈴酸Ⅰ對照品4 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇約7 mL，置水浴上微熱使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，即得(每毫升含馬兜鈴酸Ⅰ為0.4 mg)。

2.5.3 線性關系的考察 精密吸取對照品溶液25、50、100、200、250 μL，分別置1 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得濃度分別為10、20、40、80、100 μg/mL的馬兜鈴酸Ⅰ溶液。照前述色譜條件分別進樣10 μL，測定，記錄峰面積值(mAbs)。以峰面積為縱坐標(Y)、對照品濃度(μg/mL)為橫坐標(X)，繪制標準曲線。結果表明：回歸方程為Y=3.74×106X-13 916(r=0.999 5)，馬兜鈴酸Ⅰ在10～100 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5.4 供試品溶液的制備 取干燥的靈青菌質1 g，粉碎(過40目篩)，精密稱定，置于100 mL圓底燒瓶中,加10倍量60%甲醇20 mL，浸泡30 min后，水浴回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣以甲醇定容至25 mL，0.45 μm濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.5.5 馬兜鈴酸Ⅰ的含量測定 精密吸取供試品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀中,按上述色譜條件測定，外標法計算供試品中馬兜鈴酸Ⅰ的含量(mg/g)。

2.6 紫外分光光度法測定總馬兜鈴酸含量[7]

2.6.1 線性關系的考察 精密量取馬兜鈴酸Ⅰ對照品溶液(濃度為0.4 mg/mL)30、60、120、150、210 μL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度,搖勻(濃度分別為1.2、2.4、4.8、6.0、8.4 μg/mL)，照紫外分光光度常規法操作,在250 nm波長處測定樣品吸收度，以對照品吸收度(Abs)為縱坐標、濃度(μg/mL)為橫坐標(C),繪制標準曲線。結果表明：回歸方程為A=0.100 7 C+0.001(r=0.999 2)，馬兜鈴酸Ⅰ在1.2 ～ 8.4 μg/mL范圍內呈現良好線性關系。

2.6.2 總馬兜鈴酸的含量測定 精密吸取上述供試品溶液(1 g→25 mL)60 μL,稀釋并定容至10 mL，混勻，參照以上測定方法,以甲醇為參比溶液，在波長250 nm處測定樣品吸光度值，標準曲線法計算供試品中總馬兜鈴酸的含量(%)。

2.7 實驗結果

2.7.1 不同發酵時間對青木香基質轉化率的影響 以發酵時間(d)為橫坐標，基質轉化率(%)為縱坐標，繪制靈芝菌發酵青木香的基質轉化動態曲線(見圖1)。結果表明發酵至第28天靈青菌質的重量小幅下降，第28～35天相對穩定，此后菌質重量又大幅下降。

圖1 靈青菌質發酵時間-基質轉化率的動態曲線圖

2.7.2 不同發酵時間對靈青菌質中馬兜鈴酸Ⅰ含量的影響 以發酵時間(d)為橫坐標，馬兜鈴酸Ⅰ含量(mg/g)為縱坐標,繪制靈芝菌發酵青木香的馬兜鈴酸Ⅰ含量動態曲線(見圖2)。HPLC法測定結果表明，第0～28天馬兜鈴酸Ⅰ的含量基本沒有變化;第28天后馬兜鈴酸Ⅰ含量開始明顯下降，直至第56天。各發酵時間點的樣品與發酵空白比較，馬兜鈴酸Ⅰ含量均有不同程度的下降。

圖2 靈青菌質發酵時間-馬兜鈴酸Ⅰ含量的動態曲線圖

2.7.3 不同發酵時間對靈青菌質中總馬兜鈴酸含量的影響 以發酵時間(d)為橫坐標，總馬兜鈴酸含量(%)為縱坐標，繪制靈芝菌發酵青木香的總馬兜鈴酸含量動態曲線(見圖3)。UV法測定結果表明，第0～28天總馬兜鈴酸的含量保持下降的趨勢,至第28～35天后總馬兜鈴酸含量基本保持恒定，35 d后總馬兜鈴酸含量又開始上升。各發酵時間點的樣品與發酵空白比較，總馬兜鈴酸的含量均有不同程度的下降。

圖3 靈青菌質發酵時間-總馬兜鈴酸含量的動態曲線圖

3 結論

根據不同發酵時間基質轉化率、馬兜鈴酸Ⅰ含量和總馬兜鈴酸的含量測定結果可判定第28～35天左右為靈芝菌發酵青木香的發酵終點。在合理的發酵周期內，采用優化可控的發酵參數進行固體發酵，可為靈芝菌固體發酵青木香獲得靈青菌質的制備工藝提供科學的實驗依據。

藥理實驗已證實發酵35 d的靈青菌質與青木香藥材比較保持了較好的鎮痛與抗炎活性，且毒性明顯降低(另文發表)，說明運用雙向固體發酵技術靈芝菌發酵青木香的研究，確實達到了減毒持效的作用。該技術是現代生物技術在中藥研究中的應用，為含馬兜鈴酸類的中藥及其復方制劑的減毒研究提供借鑒。

[1]秘琳,王金華,王智民,等.青木香揮發油藥效學研究[J].中國中藥雜志,2007,32(21):2324-2325.

[2]王金華,王智民,姜旭,等.青木香炮制前后的藥效及毒理學比較研究[J].中國中藥雜志,2007,32(5):428-431.

[3]呂金海,舒孝順,胡興,等.青木香的抗菌活性[J].懷化學院學報,2007,26(2):69-71.

[4]高衛東,李衛民,高英,等.土木香能否代替青木香用藥的探討[J].中國藥房,2006,17(7):556-557.

[5]王智民,由麗雙,姜旭,等.利用炮制技術去除關木通毒性成分的方法學研究[J].中國中藥雜志,2005,30(16):1243-1246.

[6]李春香,丁里玉,李國川,等.復方配伍減低關木通腎毒性的實驗研究[J].中醫雜志,2006,47(9):694-697.

[7]李琳,王智民,高慧敏,等.含馬兜鈴酸類中藥材中馬兜鈴總酸的含量[J].中國實驗方劑學雜志,2006,12(2):11-13.