響應面法優化發酵工藝生產蛋白質飼料

寧德師范學院 吳明霞 陳錫雄

目前玉米酒糟作為飼料原料，具有高蛋白質、高有效磷和高維生素含量等特點，含氨基酸的種類比玉米齊全，各種必需氨基酸的絕對含量高于玉米中相應的氨基酸含量，尤其是賴氨酸的含量比玉米高2倍，且含有大量酶、酵母菌體、B族維生素。此外，發酵過程中生成的未知促生長因子，能改善胃腸微生物環境，提高畜禽免疫功能，對動物生長十分有利（趙建國和種世博，2002）。本研究以玉米酒糟為培養基生產高蛋白質含量飼料，在對發酵時間、酒糟和豆粕的比例及底物水分含量等因素進行單因素試驗的基礎上，通過響應面法對發酵工藝進行優化，以期為酒糟生產蛋白質飼料提供試驗依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 玉米酒糟：經處理后的干糟中真蛋白含量約為 25%（王穎和馬海樂，2010）；菌種：枯草芽孢桿菌、酵母。

1.2 培養基 豆粕培養液：豆粕15 g，葡萄糖1 g，pH 4.5，水 100 mL；LB 培養基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L；YPD培養基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂粉2%；酒糟平板培養基：酒糟5% ，瓊脂2% ，pH自然，121℃滅菌30 min，用于平板點種試驗；酒糟發酵培養基：干酒糟88%，麥麩10%，尿素1%，硫酸銨1%，加水至初始含水量60%。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子發酵液的配制 用生理鹽水調整菌種數1×106個/mL，接種于液體培養基中，搖床150 r/min，30℃培養24 h（張吉鵑和李龍瑞，2010）。

1.3.2 固態發酵培養基的配制 按65%含水量配制發酵基質，pH自然；攪拌，使混合液均勻于121 ℃，20 min滅菌（王俊峰，2004）。

1.3.3 響應面設計 在前期單因素試驗的基礎上，重點考察發酵時間、水分與底物比例、酒糟與豆粕比例三個因素對真蛋白質含量的影響，并用響應面法進行優化，以真蛋白質含量為響應值，根據響應面法中的Box-Behnken試驗設計原理，運用Design Expert7.0進行設計，試驗因素與水平見表1。

1.3.4 測定方法 真蛋白質含量的測定采用凱式定氮法（王俊峰，2004）。

表1 響應面分析因素與水平

2 結果和分析

2.1 響應面分析方案及試驗結果 響應面分析方案（郝學財和余曉斌，2006）和試驗結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計方案和結果

2.2 模型的建立及顯著性檢驗 利用Design-Expert 7.0軟件對表2中試驗數據進行二次多項式回歸擬合（趙志水和蒲彬，2012），獲得如下數學模型：

Y=40.48+2.83A+3.24B+1.16C+0.28AB-0.045AC-1.65BC-4.99A2-3.38B2-2.81C2。

模型的可靠性可從方差分析及相關系數來考察，結果見表3。當P＞F值小于0.05時，即表示該指標顯著。由表3可知，所建立的二次多項式具有顯著性；失擬性不顯著。一次項A、B和C均極顯著，顯著性大小為B>A>C;二次項A2、B2和C2同樣極顯著；交互項AB、AC不顯著，BC顯著。

2.3 響應面曲面分析和優化 通過模型方程所作的響應曲面圖1，可直觀地描述各因素對響應值的影響和各個因素間的交互作用（圖1）。

表3 回歸統計分析結果

由圖1可知，響應曲面均是開口向下的凸面，其中心位于所考察區域內，說明在考察的區域內存在響應值的極大值，同時響應面為高度卷曲的曲面。通過軟件分析，混菌固態發酵酒糟培養基最佳條件為：發酵時間為49.78 h，水分與底物比例為 0.85∶1，酒糟與豆粕比例為 1.53∶1。 在此條件下真蛋白質量為41.70%。

為檢驗RSM法的可靠性，采用上述最佳方案進行混菌固態發酵酒糟試驗，同時考慮實際操作的情況，將培養基優化方案修正為發酵時間50 h、水分與底物比例0.9∶1、酒糟與豆粕比例1.5∶1。實際測得的真蛋白質含量為41.66%，與理論預測值基本吻合。

3 結論

3.1 以玉米酒糟為原料，對混菌固態發酵生產蛋白質飼料的工藝方法進行研究，選擇發酵時間、水分與底物比例、酒糟與豆粕比例三個因素對真蛋白質含量影響進行分析。

3.2 通過響應面法得到發酵培養基的最佳發酵條件為發酵時間50 h、水分與底物比例0.9∶1、酒糟與豆粕比例1.5∶1，此條件下，測得的真蛋白質含量為41.66%，與理論預測值基本吻合。說明利用響應面法優化發酵工藝是可行的。

[1]郝學財，余曉斌.響應面方法在優化微生物培養基中的應用[J].食品研究與開發技術研究，2006，27：38 ～ 41.

[2]王俊峰.飼料中真蛋白質含量的測定方法[J].廣東飼料，2004，6：37～38.

[3]王穎，馬海樂.混菌固態發酵啤酒糟生產蛋白飼料的研究[J].飼料工業，2010，17：26 ～ 28.

[4]張吉鵑，李龍瑞.功能大豆寡肽蛋白飼料的研制及其固態發酵工藝參數的優化研究[J].飼料飼養，2010，10：8 ～ 14.

[5]趙建國，鐘世博.熱帶假絲酵母固體發酵黃酒糟生產蛋白飼料的研究[J].糧食和飼料工業，2002，2：22 ～ 24.

[6]趙志水，蒲彬.響應面法優化新疆紅棗總黃酮乙醇提取工藝[J].中國釀造，2012，1：88 ～ 90.