乳酸菌IIa類細菌素抗菌機制的研究

飼用微生物工程國家重點實驗室 胡小媛 王安如＊

大北農科技集團

福建師范大學生命科學學院 黃建忠＊

農業部飼料生物技術重點開放實驗室 滕 達 王建華＊

中國農業科學院飼料研究所

細菌素是由某些細菌染色體或質粒編碼、核糖體合成、具有抗菌活性的多肽或蛋白質（Deegan等，2006），主要作用于與產生菌親緣關系近的菌株（Gautam和Sharma，2009）。迄今已有許多細菌素得到分離和鑒定，以乳酸菌產生的細菌素居多，在細菌素數據庫中，乳酸菌細菌素約占65%。據統計，已有129種乳酸菌細菌素被報道，其中IIa類39種，約占30%。IIa類細菌素除了二硫鍵形成之外無其他翻譯后修飾，相對于其他細菌素具較簡單結構，因此被廣泛用于異源表達研究，并相繼在乳酸菌、大腸桿菌、酵母等系統中得到成功表達（Lohans和Vederas，2012）。本文從細胞及分子水平上歸納總結了乳酸菌IIa類細菌素的抗菌機制及其在動物消化道中的抗菌作用研究進展。

1 乳酸菌IIa類細菌素的理化特性與生物學功能

根據基本結構及性質，可將乳酸菌細菌素分為三大類（表1），其中IIa類乳酸菌細菌素是數量最多且研究比較廣泛及深入的一類。IIa類細菌素成熟肽多含37～48個氨基酸，其肽鏈大致分為兩個區域：帶正電荷、高保守的親水性N端，低保守的兩親性或疏水性C端。在高保守區N端含1個“片球菌素盒”即YGNGV/L共有序列，兩個半胱氨酸形成一個二硫鍵（Nes等，2007）。有些細菌素C端也有1個二硫鍵，如pediocin PA-1/AcH、divercin V41、enterocin A 等。 核磁共振（NMR）分析 5種 IIa類細菌素 leucocin A、carnobacteriocin B2、curvacin A、sakacin P及 sakacin P 突變體的結構顯示，N端形成β片層結構，由一個保守二硫鍵穩定其結構（Fimland等，2005）。C端為兩親性α螺旋，延伸的C末端形成發夾樣結構，含2個二硫鍵的IIa類細菌素則依靠C端二硫鍵穩定此發夾結構（Drider等，2006）。

IIa類細菌素具高等電點，pI為8～10；對熱穩定，如plantaricin 423經100℃、60 min仍保持50%活性；對酸堿耐受性強，在pH 2～11仍保持大部分活性；對胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶k等敏感，對α-淀粉酶和脂肪酶不敏感（Herranz等，2001a；Reenen 等，1998）。 除了對產生菌親緣關系近的細菌及李斯特氏菌有抑制作用外，有些寬抑菌譜細菌素，如enterocin P、pediocin PA-1等也可抑制親緣關系較遠的革蘭氏陽性菌，如金黃色葡萄球菌、梭狀芽孢桿菌、產氣莢膜梭菌等（Gautam 和 Sharma，2009；Cintas等，1997）。

表1 乳酸菌細菌素的分類

2 IIa類細菌素作用機制

2.1 細胞水平 IIa類細菌素主要通過破壞靶細胞膜穩定性導致胞內K＋、磷酸鹽、氨基酸、ATP及其他小分子物質外泄，細胞質子動力（△ψ-跨膜電勢和△pH-pH梯度）下降或崩潰，ATP耗竭，從而殺死細胞（Kjos等，2009；趙愛珍，2004）。研究報道，mesentericin Y105（600AU）可使單增李斯特氏菌膜電位在10 min內降低45%，還能抑制亮氨酸和谷氨酸轉運，使氨基酸在細胞內累積之前排出胞外（Maftah等，1993）。bavaricin MN以濃度依賴方式快速降低單增李斯特氏菌膜電位，濃度達9.0 μg/mL時靶細胞膜電位下降 85%（Kaiser和Montville，1996）。 另有報道，enterocin P 盡管不影響屎腸球菌Enterococcus faecium T136的跨膜pH梯度，但能降低跨膜電位，在靶細胞質膜上形成特定K+通道導致K+外流，引起靶細胞死亡（Herranz等，2001b）。

帶正電荷的親水性N端β片層結構通過靜電作用先與靶細胞膜上陰離子磷脂頭部極性殘基結合（Deegan 等，2006；Kazazic 等，2002），然后疏水性C端與膜脂酰基鏈作用插入到細胞膜疏水區，進而形成跨膜螺旋結構，介導細胞內各種物質及能量泄漏，引起細胞死亡（Chen等，1997；Fimland等，1996）。C端是細菌素靶細胞特異性的關鍵決定區（Todorov，2009）。細菌素C端定點突變后，靶細胞特異性發生改變，早期有研究者將不同細菌素的N端和C端進行雜交得到新細菌素，其靶細胞特異性類似于C端來源的母體細菌素（Fimland 等，2005；Fimland 等，1996）。 這些證據均表明，C端為IIa類細菌素靶細胞特異性的決定區。

2.2 分子水平 大多數IIa類細菌素殺菌作用具特異性，緣于細菌素C-端的特異性決定區與靶細胞膜表面特異受體相互作用（Kjos等，2011）。來源于pediocin PA-1 C端的15肽抑制細菌素pediocin PA-1對靶細胞的作用，而對其他細菌素無抑制作用或抑制程度較輕。研究認為，是由于15肽與細菌素pediocin PA-1競爭結合靶細胞膜中的受體的原因（Fimland等，1998）。有研究報道，IIa類細菌素是以靶細胞膜中的甘露糖透性酶EIItMan為受體，該受體屬磷酸轉移酶系統PTS，在一些細菌中主要負責糖的運輸和磷酸化（Stoll和Goebel，2010；Drider等，2006）。 甘露糖磷酸轉移酶系統Man-PTS中的 EIItMan由 IIA、IIB、IIC及 IID 四個結構域組成，形成2～4個亞基，如單增李斯特氏菌的EIItMan由3個亞基組成（IIA和IIB融合成一個亞基），由mptACD操縱子編碼，其中IIA和IIB位于細胞質，參與磷酸化；IIC和IID位于膜上，參與甘露糖轉運 （Kjos等，2011；Tessema 等，2011）。有研究表明，在單增李斯特氏菌和糞腸球菌中，編碼EIItMan的mpt操縱子定向變異會導致細菌對細菌素失去敏感性 （Dalet等，2001；Hechard等，2001）。mpt操縱子的轉錄由rpoN基因編碼的σ54因子控制，該因子可選擇性識別啟動子序列，負責特定基因的轉錄（Drider等，2006）。15年前有人構建單增李斯特氏菌轉座子突變體，發現rpoN基因缺失突變體對mesentericin Y105失去敏感性，突變體重獲rpoN基因后又恢復了敏感特性，類似現象在其他細菌如糞腸球菌中也存在 （Dalet等，2000；Robichon 等，1997）。 另外，甘油磷酰二酯磷酸二酯酶（GlpQ）、磷酸二酯酶（PDE）基因表達也會影響細菌對IIa類細菌素的敏感性，分別缺失rpoN、GlpQ及PDE基因的糞腸球菌JH2-2突變體均對IIa類細菌素divercin V41的敏感性降低，降低程度為：缺rpoN突變體>缺glpQ突變體>缺PDE 突變體（Calvez等，2007）。

Ramnath等（2004）將單增李斯特氏菌（Listeria.monocytogenes）的mptACD操縱子轉入對IIa類細菌素不敏感的乳酸乳球菌Lactococcus lactis中表達，發現重組菌株對各IIa類細菌素均敏感，且不同菌株mpt表達差異影響重組子對細菌素的敏感程度 （Kjos等，2009）。 說明，EIItMan確實作為IIa類細菌素受體在特異性和敏感性中起作用。在細菌素產生菌中，同源免疫蛋白以細菌素依賴方式結合在此受體上，防止自殺 （Diep等，2007）。EIItMan的IIC和IID位于膜上，可能是真正的受體結構域。L.monocytogenes的mptACD操縱子的每個基因分別在L.lactis中表達，結果顯示，只單獨表達mptC就足以使重組菌對IIa類細菌素敏感，進而說明IIC是IIa類細菌素在靶細胞膜上的特異受體（Ramnath，2004）。 Kjos等（2010）用敏感 L.monocytogenes的甘露糖磷酸轉移酶基因mpt和非敏感性L.lactis的甘露糖磷酸轉移酶基因ptn設計了一系列Man-PTS嵌合體和突變體，結果也顯示IIC是IIa類細菌素作用于靶細胞的特異受體。

但并非所有細菌的甘露糖透性酶均可以作為IIa類細菌素受體。Kjos等（2009）對大量細菌的甘露糖磷酸轉移酶系統Man-PTS進行了遺傳進化分析，將其分為三大類，只有第一類可作為IIa細菌素的作用受體，三個序列α、β、γ區域將第一類與其他兩類區別開來（Kjos等，2009）。另外，Man-PTS表達水平并不是決定細菌是否對細菌素敏感的唯一因素，有些對細菌素不敏感的細菌中Man-PTS表達水平與敏感菌相當，其確切機制尚無定論（Kjos等，2011）。有試驗表明，細菌細胞膜組分，如脂質、丙氨酸含量及靶細胞膜表面電荷等也是影響其細菌素敏感性的因子 （Kjos等，2011；Vadyvaloo，2004）。由于IIa類細菌素作用于靶細胞的第一步是由其帶正電荷的N端與靶細胞膜陰離子磷脂頭部極性殘基結合，所以靶膜脂質組成、電荷改變等理當會影響細菌素對靶細胞膜的親和力，從而影響細菌素活性。

3 IIa類細菌素及其產生菌在動物消化道內的作用

抗生素長期和廣泛使用導致大量病原菌產生不同程度耐藥性，嚴重威脅人畜健康。開發能有效抑制病原菌、對益生菌無害、無殘留，且不產生耐藥性的新型抗生物質迫在眉睫。

目前，細菌素作為飼料添加劑的研究報道很少，近年有關細菌素產生菌在動物體內抑制病原菌的報道較多，如用IIa類細菌素enterocin A產生菌E.faecium EK13飼喂感染Salmonella dusseldorf SA31的日本鵪鶉及感染Escherichia coli的豬仔，減少了日本鵪鶉盲腸和糞便中S.dusseldorf SA31數量，降低了豬仔糞便中E.coli數量（Strompfová 等，2006；Lauková 等，2003）。 給腸道已定植耐萬古霉素腸球菌的小鼠每天口服IIa類細菌素pediocin PA-1產生菌片腸球菌MM33，3 d后耐藥菌濃度比對照組減少78 CFU/g，對照組無明顯變化，其機制有待進一步探討（Millette等，2008）。此外，利用IIa類細菌素作為體內治療藥物控制細菌感染研究正成為一個迅速發展的領域（Lohans和 Vederas，2012）。 用小鼠模型研究細菌素在體內對L.monocytogenes的抑制效果，給感染L.monocytogenes的小鼠口服 250 μg/d純細菌素pediocin PA-1，腸道目標菌菌數在第3、6天及9天分別比對照組減少10、251CFU和25 CFU，第3天時肝臟和脾臟目標菌菌數分別減少159 CFU和1259 CFU，第6天肝臟和脾臟中已無目標菌檢出，且不影響小鼠采食量、體重以及腸道正常菌群；另一處理是給感染L.monocytogenes小鼠靜脈注射 2 μg的divercinV41，目標菌數比對照組減少2.0×105CFU，而先注射divercin V41后感染目標菌的小鼠，其目標菌數減少1.3×103CFU（Dabour等，2009；Rihakova 等，2009）。IIa 類細菌素對胃蛋白酶、胰蛋白酶等敏感，因此其應用范圍和效果受到 限 制 （Lohans 和 Vederas，2012）。Kheadr 等（2010）在模擬胃腸道環境加入純細菌素pediocin PA-1，處理90 min后，該細菌素仍保持部分活性，到十二指腸才完全失活。胃腸復雜環境及豐富的酶不利于細菌素到達靶位點發揮作用，采用特殊材料包被細菌素被認為是解決此問題的有效途徑之一（Kheadr等，2010；Colas等，2007）。

4 結語

IIa類細菌素大多由乳酸菌產生，少數IIa類細菌素由芽孢桿菌產生 （如bacillocin 602和bacillocin 1580）。乳酸菌和芽孢桿菌作為益生菌已在食品和飼料領域廣泛應用，但其益生機制尚待進一步深入研究。今后工作重點為以下幾個方面：（1）將細菌素作為此類益生菌遺傳改良的重要篩選指標，定向突變和篩選高產細菌素菌株；（2）利用分子手段改良優化細菌素序列與結構，構建高產重組菌株；（3）提高目標益生成分的抗菌活性和結構穩定性；（4）注意突破細菌素對蛋白酶敏感、口服受限的瓶頸，探索有效運載和包被技術；（5）應用細菌素部分替代常規飼料抗生素的配套技術，為飼料抗生素減量使用做好鋪墊。相信隨著相關研究不斷深入，細菌素在飼料安全、健康養殖方面將發揮重要的技術支持作用。

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