MBP68－86與MBP87－99誘導實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠的軸突損傷修復及其機制研究

趙 暉 王義周 寇 爽 李 明 齊 放 張秋霞 王 蕾*

(1.首都醫科大學中醫藥學院中藥學系，北京 100069;2.首都醫科大學中醫藥學院中醫學系，北京 100069;3.泰和誠醫療集團醫學部，北京 100013)

多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經系統(central nervous system，CNS)自身免疫反應介導的炎性神經退行性病變［1］。Vogt J等［2］研究發現，MS的主要病理特征是免疫炎性反應引起的脫髓鞘和軸突損傷等，特別是在MS早期就發生的軸突變性及神經元損傷是MS患者神經功能障礙的重要原因。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是研究MS公認的動物模型［3］。選擇堿性髓鞘蛋白(myelin basic protein，MBP)68－86及 MBP87－99均能引起 EAE。本課題組前期的實驗［4-6］也證實2種肽段MBP能夠引起大鼠EAE。本研究內容則是進一步觀察 MBP68－86及 MBP87－99在免疫誘導的EAE大鼠模型中APP及GAP-43 mRNA表達及其cAMP-PKA的變化，深入探討EAE大鼠發病過程中軸突損傷、修復及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性Lewis大鼠，體質量150～180 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號為SCXK(京)2006－0009。動物飼養在首都醫科大學實驗動物部，實驗動物許可證號:SYXK(京)2005－0022，所有實驗均經首都醫科大學倫理委員會批準。

1.2 實驗藥品和試劑

不完全福氏佐劑(incomplete freund's adjuvant，IFA)和結核分支桿菌病(mycobacterium tubercusis，H37Ra，MTB)由美國Difco公司生產。豚鼠MBP68－86(YGSLPQKSQRSQDENPV)，HPLC＞95%，由北京中科亞光生物科技有限公司合成。CAMP酶免試劑盒由美國Assay Designs公司生產。實時熒光定量RTPCR相關試劑由美國Takara及Invitrogen公司提供，引物由上海生工生物有限公司合成。DEPC H2O、Trizol試劑，由 Invitrogen公司提供。Fermentas K1622 RT逆轉錄試劑盒購自MBI公司。SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自美國應用生物公司。

1.3 EAE模型的誘導

將大鼠按數字表法隨機分成5組，正常組(n=10)、大劑量 MBP68－86模型組(n=17)、中劑量 MBP68－86模型組、小劑量 MBP68－86組模型組(n=17)和 MBP87－99組(n=13)。按不同劑量 MBP68－86(每只分別 75、50、25 μg)和MBP87－99(每只150μg)制備 EAE 模型。各模型組大鼠用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，雙后足墊皮下多點一次性注射200 μL抗原(分別含75、50、25 μg MBP68－86或 150μg MBP87－99、100 μL IFA 及 2 mg結核桿菌的混合液)免疫誘導大鼠產生EAE。正常組只注射0.9%氯化鈉注射液。

1.4 大鼠神經功能評分

造模后每天觀察動物，發病后進行大鼠神經功能評分，其評分標準如下:未發病記為0分;鼠尾張力障礙記為1分;步態不穩記為2分;完全后肢癱瘓記為3分;完全肢體癱瘓記為4分;死亡記為5分［7］。

1.5 組織取材與病理學檢查

大鼠造模后第14天和第28天，用10%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，打開胸腔，暴露心臟，經左心室灌注0.9%氯化鈉注射液，然后用4%多聚甲醛心內灌注固定，取腦組織，常規處理，石蠟包埋，常規HE染色。光學顯微鏡下觀察切片炎性細胞浸潤情況。

1.6 各組大鼠腦組織APP、GAP-43及PKA mRNA的變化

取大鼠腦組織50～100 mg，根據Trizol reagent的說明提取總 RNA。提取 RNA溶于 20 μL的 1‰DEPC水，取1 μL稀釋500倍，用核酸蛋白分析儀測RNA的濃度和純度，取A260/A280在1.9－2.1(蛋白污染指標)，A260/A230＞2.0(試劑污染指標)的RNA樣品做下一步實驗，RNA的完整性通過凝膠電泳來確定。根據RT-PCR kit的說明合成cDNA(1 μg RNA)。PCR引物采用Gene Bank Accession公布的序列，通過primer primer 5.0計算機軟件設計，由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列見表1。PCR總體系12 μL，其組成為 RNA 樣品量 2 μg，OligoDT 1μL，DEPC水補至12μL。Real time反應體系為:REAL SYBR Mixture(2×):10μL，上游引物(10μmol/L)和下游引物(10μmol/L)各 0.5μL，模板 1.5μL，加入 DEPC 水量至20μL。具體反應條件為:APP:95℃預變性5 min;95℃變性35 s，54℃退火35 s，每2個循環降1℃，72℃延伸60 s，循環40次，反應結束后，72℃延伸8 min，4℃保存;GAP-43、PKA和β-actin:95℃預變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸90 s，循環40次;反應結束后，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產物1%的瓊脂糖凝膠(0.5×TBE，每GelRed 0.8 μL 20 mL)電泳，實驗數據處理后用△△Ct表示。

表1 各項檢測指標引物序列Tab.1 Sequences of the primers of measured indicators

1.7 各組大鼠腦組織中cAMP的含量測定

稱取50 mg大鼠腦組織，放入盛有2 mL冷的50 mmol/L，pH 4.75醋酸緩沖液的試管內，勻漿，加入2 mL無水乙醇，混勻，靜止 5 min，3 500 r/min離心15 min，將上清液收集在青霉素小瓶內，再用75%乙醇2 mL洗沉淀，勻漿分散，混勻，3 500 r/min離心15 min。合并上清液，60℃烘箱中烘干，殘渣放于4℃保存。測量時用1 mL醋酸緩沖液溶解，然后取0.1 mL測量，用酶免法按照說明書要求測定上述樣品中cAMP含量。

1.8 統計學方法

運用SPSS 11.5進行統計學分析，所有數值均用均數±標準差表示，均采用單因素方差分析方法，用LSD檢驗比較兩組間差異，對于非正態分布數據選用秩和檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 EAE大鼠神經功能評分

各EAE模型組大鼠在造模第9天陸續發病，表現為體質量明顯下降，尾部張力降低，雙后肢無力，甚至癱瘓。第13天，MBP68－86不同劑量組大鼠的神經功能評分達到高峰，分別為3.4、3.1、3.3分，明顯高于MBP87－99組的 2.3 分(P=0.018 和 P=0.004)。而MBP87－99組大鼠發病緩慢，在第16天達到高峰，為2.7分(表2)。隨后評分逐漸下降，病情趨于平穩。

表2 EAE大鼠急性期神經功能評分Tab.2 Neurological score of EAE rats at acute stage

2.2 腦組織的病理學變化

HE染色光鏡下顯示，正常大鼠神經細胞胞質胞核分明，結構正常(見圖1A)。各EAE模型組大鼠腦組織病理學改變類似，各模型組在急性期均可見小血管周圍炎性細胞浸潤和神經細胞核固縮，灰白質均可受累，炎性反應以腦室周圍為主。MBP68－86各劑量組所致大鼠炎細胞浸潤較重，有大量的淋巴細胞聚集在血管周圍，并形成典型的袖套狀改變(見圖1B～D)，MBP87－99所致大鼠炎細胞浸潤較輕(見圖1E)。

2.3 各組大鼠腦組織APP、GAP-43 mRNA的表達

免疫大鼠第14天，各組大鼠腦組織APP mRNA表達無明顯變化。第 28天，中劑量 MBP68－86和MBP87－99大鼠 APP mRNA表達較正常組明顯升高(P=0.028和 0.046)，并且 MBP87－99組較小劑量MBP68－86組升高明顯(P=0.036＜0.05)。免疫后第14天，中劑量MBP68－86組大鼠腦組織 GAP-43 mRNA表達明顯降低(P=0.042)。第 28天，中劑量MBP68－86和 MBP87－99組的表達較前升高，與正常組比較無明顯統計學意義，MBP87－99組較大劑量 MBP68－86和小劑量MBP68－86升高明顯(P=0.013和0.040)詳見表3。

圖1 各組大鼠急性期腦組織的病理學改變Fig.1 Pathological changes of rats brain tissues in each group at acute stage(HE，200×)

表3 各組大鼠腦組織APP mRNA、GAP-43 mRNA的表達Tab.3 mRNA expressions of APP and GAP-43 of rats brain tissues in each group )

表3 各組大鼠腦組織APP mRNA、GAP-43 mRNA的表達Tab.3 mRNA expressions of APP and GAP-43 of rats brain tissues in each group )

*P ＜0.05 vs normal group;#P ＜0.05 vs high-dose MBP68-86 group;▲P ＜0.05 vs low-dose MBP68-86 group;MBP:myelin basic protein;APP:amyloid precursor protein;GAP:growth-associated protein.

Group___________APP mRNA__The 14th day The 28th day_____________GAP-43 mRNA__The 14th day The 28th day__Normal Group 0.97 ±0.26 0.97 ±0.26 0.91 ±0.23 0.91 ±0.23 High-dose MBP68－86(75 μg) 0.84 ±0.38 1.09 ±0.10 1.09 ±0.30 0.67 ±0.33 Middle-dose MBP68－86(50 μg) 1.02 ±0.39 1.44 ±0.28* 0.79 ±0.11* 1.24 ±0.12 Low-dose MBP68－86(25 μg) 0.58 ±0.11 0.81 ±0.15 0.88 ±0.60 0.89 ±0.05_MBP87－99(150 μg) 0.84 ±0.51 2.38 ±0.89＊▲ 1.13 ±0.52 1.61 ±0.42#▲

2.4 各組大鼠腦組織cAMP/PKA的變化

免疫大鼠后第14天，各組大鼠腦組織cAMP蛋白表達量及PKA mRNA相對表達量無明顯變化。第28 天，大、小劑量 MBP68－86及 MBP87－99組 cAMP 水平均明顯增高(P=0.008、P=0.049、P=0.010)。中劑量 MBP68－86與 MBP87－99組 PKA mRNA 表達明顯高于正常組(P=0.017或 P=0.009)，尤其是 MBP87－99組大鼠PKA mRNA表達還明顯高于大劑量MBP68－86組(P=0.022)，詳見表 4。

3 討論

MBP68－86或 MBP87－99與不完全福氏佐劑及結核桿菌混勻制成油包水的乳劑皮下注射均可制備Lewis大鼠 EAE 模型。Liu J Q 等［8-9］發現，MBP68－86是主要的抗原決定簇，而MBP87－99是很小的一個表位，給予高劑量的MBP87－99才能誘發EAE病理模型。本實驗的研究結果也是如此，病理學發現大鼠腦組織有典型的炎性細胞浸潤、脫髓鞘及軸突損傷等改變，但誘導的抗原劑量和EAE病變的程度不同。本實驗又進一步研究了 MBP68－86及 MBP87－99對 EAE 大鼠軸突損傷、修復及其可能的分子機制。

表4 各組大鼠腦組織cAMP、PKA mRNA變化Tab.4 Changes of cAMP and the expression of PKA mRNA of rats brain tissue in each group ()

表4 各組大鼠腦組織cAMP、PKA mRNA變化Tab.4 Changes of cAMP and the expression of PKA mRNA of rats brain tissue in each group ()

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal group;#P ＜0.05 vs high-dose MBP68－86 group;PKA:protein kinase;MBP:myelin basic protein.

Group ________cAMP/(pmol·mL －1)____________________The 14th day The 28th day PKA mRNA________________The 14th day The 28th day___Normal Group 28.77 ±12.91 28.77 ±12.91 1.17 ±0.21 1.17 ±0.21 High-dose MBP68－86(75 μg) 39.46 ±8.28 50.42 ±8.17＊＊ 0.86 ±0.91 1.19 ±0.20 Middle-dose MBP68－86(50 μg) 28.87 ±3.38 33.31 ±9.51 1.25 ±0.11 1.64 ±0.11*Low-dose MBP68－86(25 μg) 35.59 ±3.51 43.93 ±10.63* 0.98 ±0.35 1.20 ±0.11_MBP87－99(150 μg)____________________________41.85 ±12.36 49.84 ±3.33＊＊ 1.32 ±0.84 2.07 ±0.42＊＊#

Vogt J等［2］的發現顯示，在MS和EAE的早期就有廣泛的軸突損害，且在一定程度上與炎性反應有關，隨著病程的進展，軸突的損傷逐漸加重，并導致不可逆性神經功能障礙。APP是正常神經元跨膜糖蛋白，由快速軸突運輸轉運，它的蓄積標志著急性活動性病灶內部及慢性活動性病灶邊緣軸突功能障礙及損傷［10］。GAP-43為快速轉運胞膜磷酸蛋白，只存在于已分化定型并開始軸突生長的神經元中，為神經損傷和修復的標志物［11］。本次實驗選擇這2個標志性蛋白，從轉錄水平上評價 MBP68－86與 MBP87－99誘導Lewis大鼠腦組織軸突損傷的作用。結果表明，中劑量MBP68－86免疫大鼠14天后，腦組織GAP-43 mRNA表達較正常大鼠明顯降低，28天后APP mRNA表達較正常大鼠顯著提高。中劑量MBP68－86免疫大鼠可導致神經元物質代謝和蛋白質合成能力下降，軸突終末GAP-43 mRNA表達減少，軸漿運輸障礙，免疫反應性APP物質堆積。可作為探索多發性硬化軸突損傷的病理特點及藥物干預的實驗模型。

MS病變內廣泛軸突缺失的確切機制尚未明確。環磷酸腺苷(cAMP)是細胞內重要的第2信使，Mizrachi K等［12］研究發現，EAE大鼠細胞內cAMP水平提高，可抑制EAE大鼠Th1細胞，并且降低IFN-γ和TNF-α水平，阻止EAE的發生。cAMP可通過激活PKA系統促進神經生長或阻止抑制信號的傳遞［13］。本研究通過觀察腦組織cAMP含量及PKA mRNA表達的變化，以了解不同肽段MBP致EAE大鼠腦組織cAMP-PKA信號途徑的變化。MBP87－99免疫28 d，大鼠腦組織 cAMP與 PKA mRNA均明顯增高，而MBP68－86免疫大鼠腦組織 cAMP含量與 PKA mRNA的表達水平并不完全對應。中劑量免疫大鼠第28天后，腦組織PKA mRNA表達雖明顯高于正常組，但cAMP蛋白水平較正常組沒有明顯變化，而大劑量和小劑量免疫大鼠cAMP蛋白水平明顯增高，但PKA mRNA表達與正常組相比，差異無統計學意義。結合動物發病情況和病理變化，MBP87－99組大鼠發病進展緩慢、病程長、神經功能評分較低、病死率低、炎細胞浸潤較輕，而MBP68－86所致EAE模型疾病進展較快、動物神經功能評分較高，急性期常導致動物偏癱乃至部分死亡，炎細胞浸潤較重。MBP87－99免疫大鼠病情較輕，可能通過上調cAMP水平，激活PKA轉錄水平的表達，促進了軸突損傷后的自我修復。MBP68－86免疫后可能通過如ATP、腺苷酸環化酶和磷酸二酯酶活性，影響cAMP含量。深入了解cAMP-PKA信號途徑促進軸突再生以及cAMP-PKA與其他因子或信號之間的相互影響等問題，將為監測MS發病情況及MS的預防和治療提供了新的途徑和希望。

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