白細胞介素28B(IL-28B)基因多態性與丙型肝炎病毒(HCV)感染者自發清除的相關性

叢 瑞 佟小非 劉三都 謝 勇 尤 紅

(1.首都醫科大學附屬北京友誼醫院肝病中心，北京 100050;2.貴州省黔南州人民醫院感染科，貴州 黔南 558000;3.貴州省平塘鎮人民醫院感染科，貴州 黔南 558300)

近期多項全基因組關聯分析研究(genome-wide association study，GWAS)發現白細胞介素28B(interleukin-28B，IL-28B)的基因多態性(編碼Ⅲ型干擾素IFN-λ3)不僅與丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染者對治療的應答有關，還與急性HCV感染者的自發清除高度相關，這些位點包括rs12979860、rs8099917、 rs10853728、 rs12980275、 rs4803219、rs4803223、rs8105790 等［1-5］。然而在目前的研究中，來自中國人的研究所占比例較少，且這些研究均來自中國臺灣及美國舊金山。所以本研究探討IL-28B基因多態性與我國HCV感染者自發清除的關系。

1 對象和方法

1.1 研究對象

本研究共納入122例HCV抗體陽性的丙型肝炎病毒感染者，其中男性59例，女性63例，平均年齡24.4歲。在122例HCV感染者中有10例無法推斷其可能的感染時間。

1.2 診斷標準

根據2004年頒布的《丙型肝炎防治指南》中規定:自發清除者為有輸血史、應用血液制品史或明確的HCV暴露史，經檢測HCV抗體陽性，而HCV RNA陰性的HCV感染者;慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)患者為HCV感染超過6個月，或發病日期不明、無肝炎史，但肝臟組織病理學檢查符合慢性肝炎，或根據癥狀、體征、實驗室及影像學檢查結果綜合分析，亦可診斷。這些患者均未經過干擾素聯合利巴韋林的抗病毒治療。

1.3 材料與方法

1.3.1 基因組DNA提取及IL-28B基因分型

取患者外周血凝塊0.5 mL，采用離心柱方法(天根DP308提血試劑盒)提取全基因組DNA，按照說明書進行操作。采用紫外分光光度儀(Eppendorf公司，德國)檢測DNA濃度。運用PCR的方法對GWAS研究的候選基因:rs12979860、rs8099917、rs10853728、rs12980275、rs4803219、rs4803223、rs8105790 擴增后用3730測序儀測序并分型(由上海英駿生物技術有限公司完成)。PCR反應條件:95℃預變性10 min;95℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸40 s，共35個循環;最后72℃延伸10 min。7個位點的引物設計由Pubmed Primer blast設計，由賽百盛公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR測序引物Tab.1 Primers for PCR sequencing

1.3.2 HCV病毒定量

HCV定量檢測采用匹基試劑檢測，購自深圳匹基生物工程有限公司，檢測過程嚴格按照說明書進行，檢測下限為1 000拷貝/mL。

1.4 統計學方法

采用SPSS 11.5統計學軟件對結果進行處理，采用χ2檢驗分析不同IL-28B基因型、性別與HCV感染者自發清除病毒的關系。采用非參數秩和檢驗比較不同基因型患者病毒定量的關系。以P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 IL-28B基因的7個SNP位點的位置Fig.1 Site of 7 SNPs around IL-28B gene SNP:single nucleotide polymorphism.

2 結果

2.1 入組患者的臨床特點

122例患者中24例(19.7%)患者獲得了自發清除，98例(80.3%)轉為慢性丙型肝炎。自發清除組中，男性13例(54.2%)，慢性丙型肝炎組中，男性46例(46.9%)，兩者間性別差異無統計學意義。在明確感染時間的112例感染者中自發清除組的平均感染年齡為(17.8±14.7)歲，而慢性丙型肝炎組為(28.8±14.6)歲，兩者差異有統計學意義(P=0.002)，詳見表2。

表2 入組患者臨床特征Tab.2 General data between spontaneous clearance group and non-clearance group n(%)

2.2 IL-28B基因型HCV自發清除的關系

本研究中7個SNP位點中不同基因型患者間的自發清除率差異均無統計學意義(圖2)。

圖2 IL-28B基因型與HCV自發清除的關系Fig.2 IL-28B genotype and HCV spontaneous clearance

rs12979860位點在自發清除組中CC型22人，CT型為2人，慢性丙型肝炎組中CC型74人，CT型24人。CC基因型與CT基因型2者自發清除率分別為22.9%(22/96)、7.7%(2/26)，P=0.146;rs8099917位點在自發清除組中TT型22人，TG型為2人，慢性丙型肝炎組中TT型78人，TG型20人。2種基因型自發清除率分別為22%(22/100)、9.1%(2/22)，P=0.279;rs12853728位點在自發清除組中CC型17人，CG型為7人，慢性丙型肝炎組中CC型58人，CG型40人，2種基因型自發清除率分別為22.7%(17/75)，14.9%(7/47)，P=0.293;rs12980275 位點在自發清除組中AA型22人，AG型2人，慢性丙型肝炎組中AA型75人，AG型22人。兩種基因型自發清除率分別為 22.7%(22/97)，8.3%(2/24)，P=0.196。rs4803219位點自發清除組中CC型22人，CT型2人，慢性丙型肝炎組CC型77人，CT型21人，兩種基因型自發清除率分別為22.2%(22/43)，8.7%(2/78)，P=0.238;rs4803223位點自發清除組AA型16人，AG型8人，慢性丙型肝炎組AA型80人，AG型18人，2者自發清除率分別為16.7%(16/96)，30.8%(8/36)，P=0.109;rs8105790位點自發清除組TT型22人，TC組2人，慢性丙型肝炎組TT型73人，TC組25人。2種基因型自發清除率分別為23.2%(22/95)，7.4%(2/27)，P=0.123，詳見表3。

表3 IL-28B基因7個SNP位點與HCV自發清除Tab.3 7 SNP of IL-28B genotype and HCV spontaneous clearance n(%)

2.3 慢性丙型肝炎組患者的臨床特征

本研究入組的122例患者中，經檢測HCV RNA，其中98例患者病毒定量為陽性，成為慢性丙型肝炎患者，病毒水平中位數為5.58 log IU/mL，具體檢測結果見表4。在98例慢性丙型肝炎患者中，29例(29.6%)患者轉氨酶升高。

表4 慢性丙型肝炎患者臨床特征Tab.4 General data in chronically infected group

2.4 慢性丙型肝炎患者基線HCV RNA水平與IL-28B基因型的關系

檢測慢性丙型肝炎患者未經干擾素聯合利巴韋林治療前的基線病毒水平，采用非參數秩和檢驗比較rs12979860位點CC及CT型二者病毒載量水平(Z=－2.07，P=0.83);rs8099917位點TT型與TG型比較(Z=－0.366，P=0.715);rs10853728位點CC型與CG型比較(Z=－1.034，P=0.301);rs12980275位點AA型與AG型比較(Z=－1.034，P=0.301);rs4803219位點CC型與CT型比較(Z=－0.697，P=0.486);rs4803223位點AA型與AG型比較(Z=－0.005，P=0.996);rs8105790位點TT型與TC型比較(Z=－1.011，P=0.312)，結果差異均無統計學意義。

3 討論

本研究通過對IL-28B周圍7個SNP位點與HCV感染者自發清除之間關系的探討，發現IL-28B基因與我國HCV感染者自發清除無顯著關聯性，但患者感染時的年齡卻與HCV感染者能否自發清除病毒高度相關。來自美國的橫斷面研究［5］顯示:年齡大于20歲的HCV感染者感染后慢性化率為30%，然而小于20歲的HCV感染者為76%。另一個來自意大利的研究［6］也表明:12－25歲的HCV感染者慢性化率為56%，而年齡大于25歲的患者慢性化率則為87%。由此可見，感染時年齡越小，則自發清除率越高。本研究中自發清除組患者平均年齡較慢性化組平均年齡低，并且年齡小于20歲較大于20歲感染者自發清除率高，這些結果進一步證實年齡與HCV清除及疾病進展有關。

此外，對已經發展為慢性丙型肝炎的患者，我們也未發現IL-28B基因型與病毒載量的高低有關。王東生［7］等研究了我國394例HCV感染者rs12979860位點與HCV自發清除的關系，其中自發清除者60例，慢性丙型肝炎患者339例，結果與本研究結果類似，也未發現差異有統計學意義。究其原因，可能是由于rs12979860在我國人群中T等位基因頻率(本研究中為10%，王東生等［7］研究中為 6%)較歐洲人群(32.6%)［2］低。并且由于IL-28B基因周圍的SNP位點為基因多態性位點，不如突變位點對疾病的影響顯著。

總之，宿主因素在急性丙型肝炎病毒感染的自發清除過程中起著十分重要的作用，IL-28B基因多態性可能預測HCV自發清除率，然而仍有其他的影響因素需要進一步深入研究，尤其在我國HCV感染人群中尤為重要。

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