消化道不同惡性腫瘤患者血清鋅α-2-糖蛋白水平檢測及臨床意義

孟 倩 趙旭宏 趙 瑾 雷 婷 張 曼

(首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院臨床檢驗中心，北京 100038)

Ryden M等［1］研究發現腫瘤患者脂肪丟失與脂肪降解增加密切相關，不良的脂質代謝狀態可能會降低疾病的生存率，并且減低患者對抗腫瘤治療的耐受性。因此本實驗對一種脂質降解因子鋅α-2-糖蛋白(zincα-2-glycoprotein，ZAG)在消化道不同惡性腫瘤患者血清中的表達進行了研究，希望它能夠作為評價腫瘤患者脂代謝狀態的有效指標。ZAG是一個相對分子質量約43 000的單鏈糖蛋白，它作為一種脂解因子可以促進脂肪細胞的脂質分解，從而在許多腫瘤組織特別是惡病質狀態中呈高表達［2］，應用免疫組織化學的方法發現ZAG在某些正常分泌上皮細胞的細胞質中有表達，其中包括乳腺、前列腺、肝臟、以及唾液腺、支氣管、胃腸道和汗腺上皮細胞。因此ZAG可以分泌進入多種體液中［3］。

本實驗對消化道常見腫瘤包括胃癌、直腸癌、結腸癌、肝癌患者及正常和良性對照組患者血清中的ZAG的表達進行了初步的鑒定，并對他們血清中脂代謝相關指標進行了檢測，旨在探討這些腫瘤患者的脂質代謝狀況與ZAG的關系。

1 材料和方法

1.1 臨床標本采集及脂代謝指標檢測

實驗采集血清標本進行研究和分析，癌癥患者組樣本胃癌、直腸癌、結腸癌、肝癌各6例，良性對照組樣本胃息肉、結腸息肉、直腸息肉、肝囊腫各6例，收集正常對照組樣本6例。所有標本均來自首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院，所有患者均經過病理確診。患者年齡均大于45歲，既往體健。表1詳細列出了3組樣本的數量，各樣本的年齡性別及診斷。由首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院臨床檢驗中心在2 h內對實驗中采集的新鮮血清標本脂代謝相關指標進行了檢測，具體應用總膽固醇測定試劑盒(MERIT CHOICE)，三酰甘油測定試劑盒(MERIT CHOICE)，高密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒(SEKISUI)，低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒(SEKISUI)，對采集血清中的總膽固醇(total cholesterol，TC)，三酰甘油(triglyceride，TG)，高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDLC)，低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)進行了檢測。

表1 患者信息列表Tab.1 Patients'information list(n=6)

1.2 蛋白免疫印跡分析

血清標本經過定量后各取60 μg(總蛋白)上樣進行SDS-PAGE，電泳電壓60/120V。然后進行半干轉膜，將蛋白轉到 PVDF膜上，12V恒壓轉膜100 min。之后用含5%脫脂奶粉的 PBST(含0.05%Tween的PBS)對膜進行封閉，時間2 h。最后用下列抗體進行蛋白免疫印跡分析:一抗為鼠源性抗ZAG單克隆抗體(Santa Cruz)，β-actin單克隆抗體(Abcam)，將抗體用封閉液分別以1∶100，1∶500稀釋，將膜置于抗體稀釋液中4度過夜。翌日PBST洗膜3次，每次20 min。之后進行二抗孵育，二抗為羊抗小鼠辣根過氧化酶抗體，抗體的稀釋濃度為1∶300，室溫下在搖床上孵育90 min后，PBST洗膜3次，每次15 min。之后應用DAB增強顯色液對膜進行顯色。應用Image J分析軟件對條帶吸光度進行鑒定。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，實驗數據用均數±標準差)表示，用方差分析對脂代謝相關指標TC、TG、HDL-C、LDL-C及 ZAG在胃病組(正常健康人，胃息肉，胃癌)、肝病組(正常健康人，肝囊腫，肝癌)、結腸疾病組(正常健康人，結腸息肉，結腸癌)、直腸疾病組(正常健康人，直腸息肉，直腸癌)中每組3個樣本血清中的含量做統計學分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 脂代謝指標檢測結果

由首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院臨床檢驗中心對每種消化道惡性腫瘤及其相對應的良性組患者和正常健康人血清中的總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)進行了檢測，具體檢測結果見表2。在肝病組、胃病組、結腸疾病組、直腸疾病組中，惡性組患者血清中的TC，TG，HDL-C，LDL-C與正常人和良性組相比，差異無統計學意義(P均＞0.05)。

表2 正常組、良性組及癌癥組患者脂代謝指標列表Tab.2 The index list for lipid metabolism(mmol/L)

2.2 患者血清中ZAG的檢測結果

實驗應用蛋白免疫印跡的方法對所有樣本血清中ZAG的表達進行了鑒定(圖1)。以β-actin作為內參對胃病組(正常健康人，胃息肉，胃癌)、肝病組(正常健康人，肝囊腫，肝癌)、結腸疾病組(正常健康人，結腸息肉，結腸癌)、直腸疾病組(正常健康人，直腸息肉，直腸癌)中每組ZAG表達的相對變化水平作了半定量分析，得到了ZAG在正常組和每種疾病組樣本中倍比變化的相對比率(圖2)。統計學分析顯示在胃病組、結腸疾病組、直腸疾病組中，ZAG在惡性、良性和正常組3組間的表達差異無統計學意義(P=0.589，P=0.618，P=0.864)。而 ZAG在肝癌患者血清中的表達與正常健康人、良性組相比差異具有統計學意義(P=0.013，P=0.008)，但正常健康人與良性組患者比較，差異無統計學意義(P=0.804)。

圖1 各樣本中ZAG相對表達Fig.1 Detection the relative expression level of ZAG in all serum samples ZAG:zinc-α-glycoprotein.

圖2 ZAG在各樣本組中的相對表達Fig.2 Relative expression level of ZAG in sample groups ZAG:zinc-α-glycoprotein.

3 討論

脂質代謝狀態對腫瘤患者的生存率具有重要影響，ZAG作為一種脂質降解因子，它的表達增加與腫瘤患者惡病質的發生有關，因此對ZAG的檢測具有重要意義，它可能成為評價腫瘤病人脂質代謝狀態的一個有價值的指標。研究［4］顯示ZAG在多種生物過程中發揮作用，例如脂質代謝、受精、抗原處理和提呈等，但它的功能尚未完全研究清楚。血清中的ZAG是肝臟產生分泌的，而精液中高含量的ZAG則來源于前列腺，脂肪細胞也能合成ZAG。除了血清和精液，在尿液、唾液、汗液、腦脊液等多種體液中都能夠檢測到這種蛋白［5］。目前關于ZAG在正常健康人和消化系統不同部位惡性腫瘤患者血清中的表達狀態比較的研究未見報道。

本實驗對消化系統惡性腫瘤包括胃癌、肝癌、結腸癌、直腸癌及相應良性病組患者和正常健康人的血清中的ZAG含量做了初步鑒定;并對收集的所有樣本血清中的脂代謝相關指標 TC、TG、HDL-C、LDL-C進行了檢測。結果顯示在肝病組、胃病組、結腸疾病組，直腸疾病組患者血清中，TC、TG、HDL-C、LDL-C在正常健康人、良性病、惡性病組間差異無統計學意義。在胃病組、結腸疾病組，直腸疾病組中ZAG的含量在惡性腫瘤組、良性病變組與正常組中差異無統計學意義。而在肝病組中，肝癌患者血清中ZAG相對于正常健康人和肝囊腫表達增多，差異有統計學意義。所以我們推斷與實驗中檢測的其他消化道惡性腫瘤相比，ZAG在肝癌中的表達更具有臨床診斷意義。與CHOL、TG、HDL-C、LDL-C相比，它在評價肝癌患者脂代謝狀態方面可能更加靈敏。

［1］Rydén M，Agustsson T，Andersson J，et al.Adipose zinc-α2-glycoprotein is a catabolic marker in cancer and noncancerous states［J］.J Intern Med，2012，274(4):414 －420.

［2］Bing C，Bao Y，Aenkins G，et al.Zinc-α2-glycoprotein，a lipid mobilizing factor，is expressed in adipocytes and is upregulated in mice with cancer cachexia［J］.PNAS February，2004，101(8):2500 －2505.

［3］Tada T，Ohkubo I，Niwa M，et al.Immunohistochemical localization of Zn a2-glycoprotein in normal human tissues［J］.J Histochem Cytochem，1991，39:1221 －1226.

［4］Hassan M I，Waheed A，Yadav S，et al.Zinc α2-glyco protein:a multidisciplinary protein［J］.Mol Cancer Res，2008，6(6):892－906.

［5］Tada T，Ohkubo L，Niwa M，et al.Immunohistochemical localization of Zn-alpha2-Glycoprotein in normal human tissues［J］.J Histochem Cytochem，1991，39(19):1221－1226.