酵母細胞固定化實驗的深度解析

曹麗

生物學是一門以實驗為基礎的自然科學，觀察和實驗是生物科學教學的重要方法，是實施素質教育的良好切入點。實驗教學已成為高中生物教學內容中最重要的組成部分之一，同時也成為高考的重點和熱點，現行高考不僅考書本實驗，還考書外實驗，不僅考實驗的掌握應用，還考實驗的遷移。下面對酵母細胞固定化實驗的相關內容作一個深度解析。

1 酵母細胞固定化原理的深度解析

海藻酸鈉是由a-L-甘露糖醛酸(M單元)與b-D-古羅糖醛酸(G單元)依靠1,4-糖苷鍵連接形成的絲性共聚物，其分子為(C6H7NaO6Na)n，不同海澡酸鈉的M和G的比率和排列順序不同，其分子結構如圖1所示。由海藻酸鈉的結構式可知，海藻酸鈉含有很多游離的羧基和羥基，性質活潑，這些基團能與大多數二價或多價金屬離子發生交聯反應形成不溶于水的褐藻酸金屬鹽，如海澡酸鈉與Ca2+形成海藻酸鈣的膠體。

圖2是海藻酸鈉和褐藻酸鈣凝膠的紅外光譜圖，圖中3 370~3 420 cm-1歸屬為褐藻酸鹽中－OH伸縮振動峰，2 930 cm-1歸屬為C－H基團的伸縮振動峰，1540~1650 cm-1是褐藻酸羧基的反對稱伸縮振動峰，1 488~1 350 cm-1，是羧基的對稱伸縮振動峰，1 000~1 100 cm-1是吡喃糖環C－O伸縮振動峰。由圖可以看出，褐藻酸鈉在成凝膠前后發生的最明顯的變化就是－OH峰的位置，成凝膠前－OH峰的波數為3 395 cm-1而成凝膠后為3 418 cm-1，成凝膠后向高波數方向偏移了23 cm-1，這些變化主要是因為褐藻酸鈉成凝膠后GG段與Ca2+形成了配位結構，兩個羧基氧、一個環間氧和一個羥基氧參與了配位，由于羥基氧參與了配位降低了氫鍵締合程度使得－OH峰向高波數偏移。另外在2 930 cm-1處褐藻酸鈉在成凝膠之前C－H伸縮振動吸收較強而成凝膠后C-H伸縮振動吸收較弱，其原因在于褐藻酸鈉成凝膠后Ca2+與GG交聯形成的網格狀結構限制了六元環上C－H鍵的伸縮振動，使得偶極矩變化較小，而吸收峰較弱。

此外，1 540~1 650 cm-1和1 488~1 350 cm-1吸收強度減弱，這主要是由于鈣的交聯形成了－CO－O－Ca－O－CO－基團結構。這充分表明褐藻酸鈉中羧基與Ca2+形成了螯合結構，進而證明了海藻酸鈣分子是由Ca2+離子的交聯形成的網狀大分子。

將海藻酸鈉加入含鈣離子的介質中，鈣離子將置換海藻酸鈉大分子中的部分氫離子和鈉離子而轉化為海藻酸鈣分子，反應式為Ca2++HAlg+NaAlg＝Ca(Alg)2+H++Na+。故凝膠體中同時存在NaAlg、HAlg和Ca(Alg)2，這3種結構相互交錯連接，由于各自的結合力不同，導致整個海藻酸鈣凝膠大分子結構的空間連接力亦不均衡，產生了較大的空隙，故可容納其它的分子或細胞（如酵母細胞）。

Ca2+在整個體系中起主導作用，有助于把分子連接在一起，這種作用形成了三維結構，里斯把它稱作“雞蛋箱”結構。這些功能基團的變化為制備功能性海藻酸鈣凝膠提供理論依據，也是固定化酵母細胞的深層原理。

2 海藻酸鈣凝膠形成因素的深度解析

采用氯化鈣體系制作的海藻酸鈣凝膠，受氯化鈣濃度、溫度、海藻酸鈉的濃度影響較大，其中海藻酸鈉與氯化鈣的濃度是關鍵。馬萍老師在《海藻酸鈣凝膠微球的制備和pH依賴性溶脹》一文中指出，當海藻酸鈉的濃度小于1％或氯化鈣的濃度大于0.02 mol·L-1時均不能滴制成球，而海藻酸鈉的濃度大于4％或氯化鈣濃度高于0.2 mol·L-1時，在凝膠的表面迅速形成致密的交聯結構，阻礙了Ca2+向凝膠內部的擴散，使得內部不能形成完整的凝膠結構。當氯化鈣溶液的溫度為50 ℃時，Ca2+和褐藻酸鈉的交聯程度最好。另外褐藻酸鈉分子中M/G對海藻酸鈣凝膠的性能有著重大的影響。

3 實驗操作注意點的深度解析

（1） 海藻酸鈉濃度低會導致包埋的酵母細胞少。海藻酸鈉濃度低，導致海藻酸鈣凝膠結構中的間隙偏大，從而有一部分酵母細胞從間隙中漏出，所以包埋的酵母細胞少。

（2） 海藻酸鈉濃度過高會導致凝膠珠不成圓形或橢圓形。海藻酸鈉濃度過高時，在凝膠的表面迅速形成致密的交聯結構，阻礙了Ca2+向凝膠內部的擴散，使得凝膠內部不能形成完整的網狀結構，所以凝膠珠的形狀并不是固定的圓形或橢圓形，而會隨凝膠珠空間位置的變化而發生變化。

（3） 凝膠珠需要在CaCl2中浸泡30 min。在凝膠珠的形成過程中，先是表面形成交聯結構，然后Ca2+向凝膠內部擴散，逐層形交聯成網狀結構，Ca2+向凝膠內部擴散是一個漸近的過程，需要一段時間。

（4） 檢測拉伸強度是檢測凝膠珠制作是否成功的方法之一。凝膠珠內部的網狀結構確保凝膠珠具有較好的拉伸強度。將制作好的凝膠珠放在實驗桌上用手擠壓，若有一定彈性不容易破裂（或將凝膠珠在實驗桌上用力摔打，凝膠珠很容易彈起），則說明凝膠珠的拉伸強度較好，表明制備的凝膠珠是成功的。

（5） 用手擠壓凝膠珠是否有液體流出是檢測凝膠珠制作是否成功的方法之二。當海藻酸鈉滴入氯化鈣溶液中，液滴表面立即膠凝，然后Ca2+向凝膠內部擴散，膠凝內部逐層發生凝膠反應，凝膠珠收縮變小，凝膠中的液體被擠出而進入外部介質。如果擠壓凝膠珠有液體流出，則說明凝膠內部并沒有形成凝膠網狀結構，蓄含液體，制作不成功。

參考文獻：

［１］ 許加超．氯化鈣體系制備的海藻酸鈣凝膠特性的研究［J］．漁業科學進展，2010(1)：100-103.

［2］ 馬萍．海藻酸鈣凝膠微球的制備和pH依賴性溶脹［J］．中國海洋藥物，2003(5)：35-38.