阻斷Notch信號抑制角質形成細胞的分泌功能的研究

李冰,刁建升,楚菲菲,王大雷,郭樹忠,夏煒

[摘要]目的：探討Notch信號對角質形成細胞分泌功能的影響及意義。方法：采用角質形成細胞的血清刺激模型研究Notch信號對其分泌功能的影響。結果：血清刺激可以明顯促進Notch受體，配體及下游基因的表達，其中Notch1，Jagged1的表達明顯上升并具有時間依賴性，其下游蛋白P21表達升高，并在血清刺激后6h達到高峰，P63表達下降，并在血清刺激后6h，下降幅度最大。此外給予血清刺激后，纖維化相關因子（包括TGF-β1，TGF-β2，IGF-1，CTGF，VEGF及EGF）的表達明顯升高，并在12h達到高峰。給予DAPT（N-[N-(3,5-Difluorophenancetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester，γ分泌酶抑制劑)進行Notch信號阻斷后，明顯抑制其下游蛋白P21的表達，提高的P63的表達水平，同時抑制了纖維化相關因子的表達。結論：阻斷Notch信號能夠明顯抑制角質形成細胞分泌纖維化相關因子。

[關鍵詞]瘢痕；Notch信號；角質形成細胞；血清刺激模型；纖維化相關因子

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）04-0576-04

Blocking Notch signal pathway suppress profibrotic growth factor production in keratinocyte

LI Bing,DIAO Jian-sheng,CHU Fei-fei,WANG Da-lei, GUO Shu-zhong, XIA Wei

(Institute of Plastic Surgery, Xijing Hospital,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveTo study the impact of Notch signaling on the profibrotic growth factor production in keratinocyte.MethodsTo mimic the components of the acute wound microenvironment, we used serum stimulation model in vitro.Results We found that expression of Notch1 and Jagged-1 in keratinocytes was significantly higher after serum stimulation, and shown time independent. After keratinocytes serum stimulation, the expression of P21 was significantly up-regulated and had a peak at 6h, while the expression of P63 was down-regulated with the biggest fall at 6h. Besides, the result of real time PCR suggested that nearly all the detected profibrotic growth factors had a peak at 12h after serum stimulation, in absence of DAPT. DAPT decreased the expression of profibrotic growth factor production at all the indicated time, and had the most potent effect at 12h. But in presence and absence DAPT, the variation tendency of TGF-β1 expression was nearly the same, so was VEGF. Maybe this is related to the low dose of DAPT(10μM).ConclusionBlocking Notch signaling pathway can suppress probrotic growth factor production in keratinocyte.

Key words:cicatrix; Notch signal pathway; keratinocyte; serum stimulation model; profibrotic growth factor

皮膚創傷后過度愈合常常導致瘢痕增生，尤其是大面積燒傷后常形成增生性瘢痕，不僅影響外表，而且常會給患者帶來功能障礙，影響患者身心健康。但其發病機制目前尚未明確闡明。表皮異常的旁分泌功能在瘢痕增生中發揮著重要作用[1-3]。在本課題組前期的研究中發現，在增生性瘢痕的表皮增厚，但其基底細胞減少，上層細胞增多，即表現為增殖減低，過度分化狀態，同時發現Notch信號相關分子在增生性瘢痕表皮過量表達及活化[4]。此外，本課題組前期利用DAPT局部注射能夠明顯抑制兔耳瘢痕增生[5]，同時增生性瘢痕表皮的過度分化狀態也得到了逆轉。Notch信號是調節表皮增殖分化的重要信號途徑，因此我們推測，創傷后，可能由于Notch信號相關分子的大量表達及過度活化導致表皮的增殖分化異常[6-7]，進而產生大量的纖維化相關因子，導致瘢痕增生。本研究即通過血清刺激模型，體外模擬體內急性創傷，來研究Notch信號對角質形成細胞分泌功能的影響，為Notch信號在瘢痕增生中促進作用提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑及材料：角質形成細胞購買于美國ATCC公司，無血清KGM（Serum free basal keratinocyte growth medium，無血清角質形成細胞基礎培養基）及添加劑購買與美國ATCC公司；胰酶及EDTA（Ethylene Diamine Tetraacetie Acid，乙二胺四乙酸）產于英國Sigma公司，購買于西安沃爾森生物技術公司；DAPT（N-[N-(3,5-Difluo rophenancetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butylester，γ分泌酶抑制劑)產于美國ALEXIS公司，購買于西安沃爾森生物技術公司；FCS（（fetal calf serum，胎牛血清）產于美國Hyclone公司，購買于西安沃爾森生物技術公司；TriPure分離試劑產于德國Roche公司，購買于西安沃爾森生物技術公司；反轉錄試劑盒及SYBR GreenⅠ實時熒光定量試劑盒產于并購買于大連寶生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 角質形成細胞培養： 凍存的角質形成細胞以1000～5000細胞/cm2密度復蘇后培養于無血清的KGM完全培養基中, 當細胞達到70%～80%融合，利用0.02%胰酶和0.05%EDTA進行消化傳代，直到第四代細胞用于血清刺激模型建立。

1.2.2 血清刺激模型建立及DAPT處理： 將角質形成細胞在KGM成基礎培養基中靜置17h，加入或不加10μM DAPT，孵育2h后，加入10%FCS，于血清刺激后0h、1h、6h、12h及24h收集細胞及培養上清。

1.2.3 Real-time PCR檢測：采用TriPure試劑按說明書進行RNA提取。DNase I 37℃，10～3Omin，以去除基因組DNA污染。RNA沉淀，重懸后進行定量。利用反轉錄試劑盒按照說明書對RNA進行反轉錄。采用SYBR Green I染料在MJ Research 0ption 2熒光定量PCR儀上檢測目的基因的表達。PCR反應體系20μl。PCR反應條件：激活95℃，10 min；40個循環，變性95℃，15 s；退火55℃，30 s，延伸72℃，30 s；分別在78℃、80℃、82℃和85℃時檢測熒光。擴增完畢后，進行熔解曲線分析，95℃，1 min，65℃，l min，以0.10℃/s的速度升溫到95℃，連續監測熒光。擴增結束后分析熔解曲線，在熔解曲線上以具有單峰判斷PCR擴增的單一性。同時設無模板對照，每份標本行3次Rea1-time PCR檢測，取平均值。對cDNA模板進行倍比稀釋，以1.0×、0.5×、0.25×、0.125×四個濃度梯度的cDNA模板進行Rea1-time PCR擴增。將不同濃度模板的對數和相應到達閾值的循環數(ct值)作圖，做標準曲線?；騧RNA表達采用直線相關回歸分析，管家基因GAPDH的表達量作為內參照，分析目的基因的相對表達量。

1.2.4統計學處理：應用STAT4．0軟件進行統計分析，用方差分析處理數據。

2結果

2.1 血清可以明顯刺激角質形成細胞Notch信號相關分子的表達與活化。血清刺激后，Notch1及Jagged1表達明顯上升，并呈現時間依賴性。此外，Notch下游分子，P21表達明顯升高，并在血清刺激后6h達到高峰（P=0.0004）；P63表達下降，并在血清刺激后6h下降幅度最大（P<0.0001）。

2.2 血清明顯刺激纖維化相關因子的表達。由于給予細胞的是單次血清刺激，所以我們只能短時間觀察纖維化相關因子表達變化。其中TGF-β2、IGF-1、CTGF及EGF于血清刺激后12hmRNA表達高峰，到24h表達開始下降；而TGF-β1表達緩慢升高，直到血清刺激24h尚未出現明顯表達高峰；VEGF于血清刺激后1h即出現了明顯的高表達。

2.3 阻斷Notch信號抑制了纖維化相關因子的表達。由于我們在給予血清刺激前2h及對細胞進行了DAPT處理，因此血清刺激0h，Notch信號下游分子及纖維化相關因子表達即出現不同的表達差異。DAPT明顯抑制了P21表達，1h即達到了最大的抑制作用（P<0.0001）；DAPT處理后，P63表達明顯升高，12h升高作用達到最大（P<0.0001）。TGF-β2（P=0.0147）、IGF-1（P<0.0001）、CTGF（P<0.0001）及EGF（P=0.0004）于血清刺激12h，DAPT的抑制作用達到最大；TGF-β1（P=0.0003）及VEGF（P=0.0033）于血清刺激1h，DAPT即有明顯抑制作用。

3 討論

Notch信號通路是人體重要信號通路之一，其信號分子在機體內的各個器官中均有表達，調節細胞周期、細胞增殖及凋亡。皮膚作為人體重要的器官，Notch及其配體在表皮細胞的多種細胞均有大量表達，且特異性的Notch信號活化在維持皮膚細胞自身更新及分化過程中起到重要意義。

人類細胞的Notch存在五種配體：Delta like1，Delta like3，Delta like 4，Jagged1及Jagged2；及四種受體：即Notch1、Notch2、Notch3及Notch4。在人表皮中，各層表皮細胞均有Notch1分子表達，但Notch2只表達在基底細胞表面，而且Notch配體（例如：Jagged和Delta-like家族）與Notch受體作用是交叉的[8-9]。盡管Notch配體和受體的表達模式有差異，但通過對人類和小鼠的角質形成細胞研究結果表明，任何配體激活的Notch信號都具有誘導分化的能力[10-11]。Notch在表皮的研究中，主要集中的Notch信號對表皮增殖及分化的調節作用的研究。在表皮，Notch信號活化后，直接誘導其下游分子P21表達，抑制P63表達，進而誘導表皮分化，抑制表皮增殖。P21具有調節細胞周期的功能，也被稱為Waf-1和Cip-1[10]。P21的表達增多會導致正在增殖的角質形成細胞出現細胞周期停滯，進而促進細胞向終末期細胞分化；而P63在維持表皮的增殖能力中起著重要作用。在Notch信號對病理性瘢痕的作用研究中發現，增生性瘢痕組織中出現角質形成細胞的過渡分化，其原因可能與Notch1和Jagged1在角質形成細胞過表達引起P21表達上調P63表達下調有關[11]。

表皮的分泌功能在皮膚的病理生理過程中都起到了重要作用。大量的研究表明，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的表皮常常會大量的分泌纖維化生長因子（包括TGF-β、CTGF、IGF-1、EGF、VEGF、PDGF、bFGF 等），這些生長因子透過基底膜到達真皮，進而促進真皮成纖維細胞的增殖及膠原合成，導致瘢痕增生[12-14]。但是關于Notch信號對表皮分泌功能的影響目前尚未見報道。而我們利用血清刺激模型進行的體外研究發現，阻斷Notch信號后，不僅抑制了血清刺激的表皮的增殖能力下降及過度分化狀態，也抑制表皮細胞分泌纖維化相關因子（包括TGF-β、CTGF、IGF-1、EGF、VEGF）。

Notch信號是生物進化中存在的非常保守的信號途徑之一。其活化后影響很多下游基因的轉錄，目前在表皮研究的Notch作用比較確定直接的下游分子即包括P21和P63，此外還有Wnt信號，AP-1等[5]。但是關于Notch對纖維化相關因子的轉錄調節，目前相關研究還很少，而且多是集中在Notch信號于VEGF的相互作用在血管再生方面的研究[15]。關于Notch信號于TGF-β相互作用的研究多集中在內臟器官的纖維化方面[16-17]，即TGF-β促進了內臟器官內皮細胞向間質細胞轉換，阻斷Notch信號后，可以明顯抑制TGF-β的作用，但并未指出二者是上下游的調節關系。而我們的研究提示Notch信號參與表皮分泌纖維化相關因子的調節，阻斷Notch信號可以抑制表皮的分泌功能，進而抑制瘢痕形成，為瘢痕形成提供了新的機制，為瘢痕防止提供新的治療思路。

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[收稿日期]2011-12-26 [修回日期]2012-02-16

編輯/張惠娟