十精丸對UVA致ESF-1細胞光老化保護作用的研究

陳麗娟,王加志,徐姣,齊永華,黃昕紅

[摘要]目的：研究十精丸抗紫外線致ESF-1細胞光老化作用，并初步探討其作用機制。方法：用40J/cm2的UVA照射人皮膚成纖維細胞建立光老化細胞模型，以不同濃度十精丸提取物處理光老化細胞，MTT法檢測細胞活力，羥胺法檢測細胞超氧化物歧化酶（SOD）活性，比色法檢測谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，TBA法檢測丙二醛（MDA）含量。結果：UVA照射成纖維細胞后，細胞活力下降，SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高（P<0.01），十精丸水提液中（100μg/ml）、高（200μg/ml）劑量組能顯著提高成纖維細胞細胞活力、SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量（P<0.05或P<0.01）。結論：十精丸水提液可抑制UVA引起的成纖維細胞活性下降，推測其機制為通過提高SOD活力、加速氧自由基的清除和減少氧自由基的產生，使細胞的脂質過氧化損傷程度降低有關。

[關鍵詞]十精丸；UVA；ESF-1細胞；光老化

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）04-0582-03

Protective effect of Shijingwan on photoaging induced by Ultraviolet A in ESF-1 cell

CHEN Li-juan,WANG Jia-zhi,XU Jiao,QI Yong-hua,HUANG Xin-hong

(Department of Cosmetology,Jiamusi College, Heilongjiang University of Traditional ChineseMedicine,Jiamusi 154007,Heilongjiang,China)

Abstract: ObjectiveTo study the protective effect of Shijingwan agains UV irradiation-induceddamage in ESF-1 cells and its mechanism.MethodsThe model of photoaging fibroblasts was established by irradiating of ultraviolet light(40J/cm2). The different concentration water-extract solution from Shijingwan were used for photoaging cell. The proliferation of human fibroblasts was detected by MTT, and superoxide dismutase(SOD) and glutathione peroxidase(GSH-Px) activity, malondialdehyde(MDA) content were assayed by hydroxylamine, colorimetric and TBA methods respectively.ResultsThe proliferation activity of fibroblasts descended with the UVA irradiation, the activities of SOD and GSH-Px decreased, when the content of MDA was ascensive(P<0.01). But under the intervention at middle concentration(100μg/ml) and high concentration(200μg/ml) of water-extract solution from Shijingwan,the above changes induced by UVA irradiation were inhibited(P<0.05 or P<0.01).ConclusionThe water-extract solution from Shijingwan might inhibit the proliferation decreasing which induced by UVA. And its mechanism is due to its abilities of increasing SOD，scavenging oxygen free radicals.

Keywords:Shijingwan; UVA; ESF-1cell; photoaging

皮膚長期暴露于紫外線（UV）下可導致結構及功能的改變，從而加速或導致皮膚老化的發生，這種因UV照射引起的老化被稱為光老化。皮膚光老化不僅有損于人的美容，而且可能與皮膚癌的發生也有著病因學的聯系[1]。隨著當前生態環境的惡化，皮膚光老化現象愈來愈嚴重，嚴重影響著人們的身心健康。十精丸為補腎方藥之一，出自明代《普濟方·卷二百二十三·諸虛門·補虛駐顏色附論》，是中醫美容保健、延年益壽之傳統名方。但目前十精丸抗皮膚光老化的基礎實驗研究薄弱，嚴重限制了十精丸療效的進一步發揮。筆者以體外培養人皮膚成纖維細胞ESF-1為研究對象，在體外成功建立ESF-1 UVA光老化模型，探討十精丸水提液對UVA損傷ESF-1細胞的保護作用。

1材料和方法

1.1實驗材料和儀器

1.1.1材料：皮膚成纖維細胞ESF-1（北京協和細胞中心），DMEM培養基（Gibco公司，批號：12800-058），胎牛血清（Billab公司，批號：20101030）、胰蛋白酶（Billab公司，批號：20100901）、雙抗（Billab公司，批號：20101230），MTT（Sigma公司），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒測定試劑盒（南京建成生物工程公司，批號為：20110107），中藥菟絲子、肉蓯蓉、柏子仁、白茯苓、山茱萸、熟地、桂心、菊花、蜀椒、枸杞（北京同仁堂制藥集團哈爾濱分店，經鑒定為正品）。

1.1.2 儀器：紫外照射儀（Sigma公司），紫外線輻照計（北京師范大學光電儀器廠），Resecarch UV UF型超純水制備系統（上海和泰儀器有限公司），LDZX-4DSBI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠），IX-71-21PH型Olympus倒置顯微鏡（日本 Olympus株式會社），HF90型二氧化碳培養箱（上海智城分析儀器有限公司），酶標儀（上海熱電儀器有限公司），MS-500A半自動生化分析儀(美生科技有限公司)，冷凍干燥儀（上海熱電儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物的配置：按十精丸藥物組成及藥量(十味各等份，共100克)，加1000ml蒸餾水加熱煮沸30min，5層紗布過濾，濾渣加1000ml水再提取兩次，合并三次濾液，濃縮成浸膏，經冷凍干燥制成粉末，保存于4℃冰箱中備用。實驗時取十精丸水提液凍干粉用DMEM培養液配成所需濃度，調pH值為7.0，0.22μm微孔濾膜過濾除菌。

1.2.2 成纖維細胞ESF-1的體外培養：皮膚成纖維細胞ESF-1在含有10%胎牛血清的DMEM，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。取對數生長期的細胞以0.25%胰酶和0.02%EDTA消化，調整其密度為105個/ml，定量接種于96孔板中備用。

1.2.3 細胞光老化模型的建立：根據文獻[2]計算紫外線的照射劑量，照射劑量（J/cm2）=照射強度（W/cm2）×照射時間（s），照射強度通過紫外線輻照計測量來測量。

按照文獻[3-5]方法，將處于對數生長期的細胞接種于96孔板，待細胞單層貼壁后（24h），棄培養液，每孔加入150μl PBS，分別使用40J/cm2的UVA照射，正常組用鋁箔蓋住。

1.2.4 實驗分組：按照預實驗結果，將處于對數生長期的細胞接種于96孔板，隨機分為正常對照組、模型對照組、十精丸水提液低（50μg/ml）、中（100μg/ml）、高（200μg/ml）劑量組。接種24h后各組棄培養液，每孔加入150μl PBS，除正常對照組外，按照2.3的方式造模。照光后棄去PBS，藥物組加入含藥的DMEM培養基，對照組加入不含藥DMEM培養基，繼續培養。以上各組細胞每組設6個復孔。

1.2.5 MTT檢測細胞活力：五組均進行以下操作：接種于96孔板中的細胞，在第48h向每孔加入20μl MTT（5mg/ml），繼續培養，4h后棄上清，每孔加150μl DMSO溶解，室溫，振蕩10min，使結晶溶解，酶標儀檢測各孔492nm處的光吸收（OD）值，然后按公式（1）計算細胞活力：

1.2.6 檢測細胞培養液中SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量：嚴格按照檢SOD、GSH-Px和MDA試劑盒說明書操作。

1.2.7 統計學方法：用SPSS13.0軟件對結果進行統計分析，各組數據以x±s表示，多樣本間的方差分析采用LSD法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 十精丸水提液對ESF-1細胞細胞活力的影響：見表1。由表1得，模型對照組與正常對照組相比，差異有統計學意義（P<0.01），說明模型制作成功。十精丸水提液各劑量組OD值均高于模型對照組，且在此劑量范圍內，隨著濃度的增加呈升高的趨勢。十精丸水提液中、高劑量組與模型對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。

2.2 十精丸水提液對ESF-1細胞SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量的影響：見表2。由表2得，與正常對照組相比，模型對照組的SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型對照組相比較，十精丸水提液各劑量組均能提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量；且十精丸水提液中、高劑量組與模型對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。

3討論

3.1 日光中的紫外線（UV）是引起皮膚損傷的主要環境因素，它可增加皮膚組織中的氧自由基，引起氧化損傷，同時可引起局部和系統免疫抑制和細胞凋亡，造成DNA損傷誘發突變，導致皮膚炎癥、曬傷、光老化及皮膚腫瘤[1]。輻射到地面的UV主要是UVA（320～400nm）和少量UVB(290～320nm)，以往研究多集中于中波紫外線對人皮膚的損傷，而對長波紫外線UVA(320～400nm)的研究較少。陽光紫外線中所含的UVA具有很強的穿透作用(大約1 mm)，可影響位于真皮層的成纖維細胞[6]，影響皮膚膠原合成，進而引起皮膚光老化。目前從天然植物和傳統藥物中開發防皮膚光老化藥物已成為國內外研究熱點[7]。

3.2 十精丸出自明代《普濟方·卷二百二十三·諸虛門·補虛駐顏色附論》，由枸杞、熟地、桂心(肉桂)、菊花、山茱萸、菟絲子、肉蓯蓉、蜀椒、柏子仁、白茯苓(茯苓)十味中藥組成。是中醫美容保健、延年益壽之傳統名方。其功效為“溫腎滋腎，益精填髓，養心益智、平肝明目；烏須發，悅容顏，久服能輕身延年”。從以往的理論和研究看[8]，該方具有抗皮膚光老化，緩解紫外線對皮膚細胞損傷的潛在功效。在此筆者對十精丸水提液對UVA誘導的人皮膚成纖維細胞損傷的保護作用進行了初步研究。

3.3實驗結果表明，40J/cm2的UVA照射導致ESF-1細胞SOD和GSH-Px的活性顯著下降， MDA含量明顯升高，細胞活力下降，證實了UVA可降低人真皮組織細胞清除和防御ROS的能力并導致氧化損傷。十精丸水提液低劑量組（50μg/ml）保護ESF-1細胞免受UVA損傷的作用效果不明顯；中（100μg/ml）、高劑量組（200μg/ml）均能顯著提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，增強細胞活力，有效地對抗UVA對成纖維細胞氧化性損傷。

綜上，十精丸可明顯保護人成纖維細胞ESF-1免于UVA損傷，其具體機制可能與抑制氧化損傷和增強細胞抗氧化能力有關。本研究結果為開發天然光防護劑提供了理論依據，豐富十精丸抗皮膚光老化的理論研究，為其臨床應用奠定基礎。

[參考文獻]

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[收稿日期]2011-10-20[修回日期]2012-01-18

編輯/張惠娟