阿司匹林對正常人表皮黑素細胞系PIG1細胞黑素生成的影響

湯玲珍,堅哲,劉邦民,李凱,李強,李春英,高天文

[摘要]目的：觀察阿司匹林對體外培養的正常人表皮黑素細胞系PIG1細胞的活力、黑素生成及酪氨酸酶活性的影響。方法：用不同濃度的阿司匹林處理PIG1細胞72h，CCK-8比色法測定阿司匹林對PIG1細胞活力的影響；光學顯微鏡觀察細胞形態學變化；氫氧化鈉裂解法測定黑素的含量；體外多巴氧化反應法測定酪氨酸酶活性的變化。結果：阿司匹林濃度小于或者等于500μmol/L時無明顯細胞毒性；濃度大于或者等于125μmol/L時以劑量依賴方式抑制黑素生成，差異有統計學意義（P<0.05）；黑素細胞酪氨酸酶活性無顯著性變化（P>0.05）。結論：阿司匹林抑制PIG1細胞的黑素生成，可能應用于色素增多性皮膚病。

[關鍵詞]阿司匹林；黑素細胞；黑素生成；酪氨酸酶

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）04-0593-03

Effects of aspirin on melanogenesis of human epidermal melanocyte cell line PIG1 cells in vitro

TANG Ling-zhen,JIAN Zhe,LIU Bang-min,LI Kai,LI Qiang,LI Chun-ying,GAO Tian-wen

(Institute of Dermatology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032, Shaanxi,China)

Abstrat:ObjectiveTo investigate the effects of aspirin on cell viability, tyrosinase activity and melanogenesis of human epidermal melanocyte cell line PIG1 cells in vitro.MethodsAfter treating PIG1 cell with aspirin in different concentrations for 72h, we employed CCK-8 assay, oxidative DOPA reaction and NaOH method to measure the cell viability, tyrosinase activity and melanogenesis of PIG1 cells respectively. The morphologic changes of PIG1 cells were observed via light microscope.ResultsAspirin had no significant effect on the cell viability of PIG1 cells when the concentrations were lower than 500μmol/L. The melanogenesis of PIG1 cells was remarkably decreased in a concentration-dependent manner by aspirin at the concentrations higher than 125μmol/L (P<0.05). However the tyrosinase activity had no significant change after aspirin treatment (P>0.05).ConclusionAspirin can inhibit the melanogenesis of PIG1 cells, thus it may be developed as a clinical treatment of hyperpigmented skin diseases.

Key words: aspirin; melanocyte; melanogenesis; tyrosinase

人皮膚顏色的深淺主要由表皮中黑素細胞生成的黑素量決定，抑制黑素生成一直是皮膚美白及治療色素增多性疾病的主要策略。酪氨酸經過一系列氧化反應生成黑素的過程中，需要活性氧的參與[1]，因此，抗氧化劑通常能減少活性氧來抑制黑素的生成[2]。阿司匹林是臨床常用的非甾體類抗炎藥（NSAIDs），具有解熱、鎮痛、抗炎等作用。近年來有研究證實阿司匹林具有清除自由基及抗氧化作用[3-4]。有研究發現阿司匹林能降低小鼠B16黑素瘤細胞的酪氨酸酶表達[5]，但阿司匹林對正常人黑素細胞黑素生成及酪氨酸酶活性的影響還未有研究報道。本研究探討了阿司匹林對體外培養的正常人表皮黑素細胞系PIG1細胞的黑素生成及酪氨酸酶活性的影響，為其應用于色素增多性皮膚病的預防和治療提供實驗依據。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1永生化正常人表皮黑素細胞系PIG1細胞：本實驗室保存。由美國Loyola 大學Caroline Le Poole博士贈送。為正常新生兒包皮組織運用逆轉錄病毒載體轉染16型人乳頭瘤病毒E6和E7開放讀碼框得來，與正常黑素細胞生物學特性相似[6]。

1.1.2主要試劑和儀器：254培養基及人黑素細胞生長添加劑（美國Cascade Biologics/Invitrogen公司），胎牛血清（美國GIBCO公司），阿司匹林（美國Sigma公司），CCK-8（江蘇碧云天生物技術研究所），0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（北京索萊寶科技有限公司），NaOH（天津石博迪化工有限公司），左旋多巴（L-DOPA）（美國Amresco公司），TritonX-100（江蘇碧云天生物技術研究所），倒置顯微鏡（日本Nikon公司），酶聯免疫分析儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2方法

1.2.1試劑配制：使用前，人黑素細胞生長添加劑以1:100體積比加入到254培養基中。阿司匹林先用無水乙醇溶解配制成0.5M溶液，再用無血清254培養基配制成10mM濃度的阿司匹林原溶液，保存于4℃冰箱內。

1.2.2細胞培養：PIG1細胞置于含5%胎牛血清，100U/ml青霉素及100mg/ml鏈霉素的254培養基中，37℃含5%CO2孵箱內培養。

1.2.3 阿司匹林對PIG1細胞活力影響的測定：采用CCK-8法，取對數生長期細胞，常規消化離心后，調節細胞濃度至2×105/ml，以100μl/孔接種于96孔板，37℃ CO2孵箱培養24h，細胞完全貼壁后吸去原培養基，分別加入100μl無血清254培養基配制的終濃度為62.5μM、125μM、250μM、500μM、1000μM、2000μM的阿司匹林溶液，對照組只加無血清254培養基，每組設3個復孔，并設立空白組（單純培養基）。37℃ CO2孵箱培養72h后，先用倒置顯微鏡觀察PIG1形態學變化，接著分別向空白組、對照組、阿司匹林處理組每孔加入10μl CCK-8溶液，37℃孵箱內繼續孵育90min，酶聯免疫分析儀450nm處測吸光度值（A）。阿司匹林處理組相對細胞活力=（A阿司匹林組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。

1.2.4阿司匹林對PIG1細胞黑素生成影響的測定[2]：采用NaOH裂解法，取對數生長期細胞，常規消化離心后，調節細胞濃度至5×105/ml，接種及分組同上。阿司匹林處理72h后，吸去上清，用1×PBS洗2次，每孔加入100μl濃度為1M的NaOH溶液，37℃水浴1h，酶聯免疫分析儀測定450nm波長的吸光度值（A）。阿司匹林處理組相對黑素含量=（A阿司匹林組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。

1.2.5阿司匹林對PIG1細胞酪氨酸酶活性影響的測定：采用體外DOPA氧化反應法,細胞接種方法和分組同黑素含量測定。阿司匹林處理72h后，吸去上清，用1×PBS洗2次，每孔加入90μl濃度為1%的TritonX-100溶液，迅速置于-80℃冰箱內凍存30min，室溫下融化使細胞完全裂解。每孔加入100μl濃度為0.1%的L-DOPA（1×PBS配制）溶液，37℃孵育2h，酶聯免疫分析儀測定490nm波長的吸光度值（A）。阿司匹林處理組相對酪氨酸酶活性=（A阿司匹林組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。

1.3 統計學分析：數據以x±s表示，利用SPSS12.0進行單因素方差分析。

2結果

2.1 阿司匹林對PIG1細胞形態及細胞活力的影響：阿司匹林濃度在62.5～500μM時，PIG1細胞形態與對照組相比，無明顯差異。阿司匹林濃度大于1000μM時，細胞樹突變短，胞體肥大。細胞活力檢測結果為阿司匹林在濃度小于或等于500μM時，細胞活力與對照組相比無統計學差異（P>0.05）。阿司匹林濃度大于或者等于1000μM時，細胞活力以劑量依賴方式降低，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）（圖1、2）。

2.2 阿司匹林對PIG1細胞黑素生成的影響：阿司匹林在62.5～500μM濃度范圍內，以濃度依賴方式降低黑素生成量，其中125μM 、250μM、500μM阿司匹林處理組黑素生成量的降低具有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.3阿司匹林對PIG1細胞酪氨酸酶活性的影響：阿司匹林在62.5～500μM濃度范圍內，酪氨酸酶活性與對照組相比，無明顯差異（P>0.05）（表2）。

3討論

3.1 一直以來，色素增多性疾病如炎癥性色素沉著、黃褐斑等都是困擾皮膚科醫師的難題。如何在不殺傷黑素細胞的情況下降低黑素合成一直是研究者不斷探索的治療方法。近年來，從植物中提取的具有抗氧化性質的活性成分，如姜黃素[2]、茶黃素[7]、槲黃素[8]、萊菔硫烷[9]等，被證實具有抑制黑素生成的作用。阿司匹林最初來源于柳樹，同樣發現其具有清除自由基及抗氧化作用[3-4]，因此我們研究了阿司匹林對黑素細胞黑素生成及酪氨酸酶活性的影響。

3.2 本實驗中，通過對正常人表皮黑素細胞系PIG1細胞的培養，我們觀察到濃度在62.5～500μM之間的阿司匹林對黑素細胞無明顯毒性，降低了黑素生成量，但是對酪氨酸酶活性無顯著影響。之前Sato K等[5]發現2mM阿司匹林作用5天后，小鼠B16黑素瘤細胞的黑素生成量顯著降低，酪氨酸酶蛋白量顯著降低，但是體外酪氨酸酶活性無顯著變化，與本實驗結果基本一致，有些差異可能由于細胞系不同或體外實驗誤差導致。研究顯示大多數藥物是通過抑制酪氨酸酶活性來抑制黑素生成[2,8- 9]，但是酪氨酸羥基化形成多巴與多巴氧化形成多巴醌最終生成黑素的一系列反應過程中，涉及多種信號通路，如腺苷酸環化酶/cAMP-依賴蛋白激酶通路、MAP激酶通路、PI激酶/p70SG激酶通路、PKC依賴通路[10]，除了主要的調控因素酪氨酸酶，相關的調控或影響因素還有Pmel基因家族、內皮素、過氧化物酶、多巴醌及轉錄因子MITF[10-11]，因此阿司匹林可能通過其他途徑抑制黑素生成，如可通過抑制COX或NF-κB等影響某個信號通路，導致黑素生成或轉運過程中某個步驟改變，或者通過清除自由基改變黑素生成反應中的氧化還原反應，導致不同類型黑素顆粒或者黑素前物質比例改變，進而影響了黑素的生成量。因此，明確阿司匹林對黑素生成的具體影響機制，還需要進行深入的研究來證實。

3.3 阿司匹林臨床應用廣泛，具有價格實惠、安全性強以及較易推廣的特點。臨床上有經驗顯示非甾體類抗炎藥治療炎癥后色素沉著有良好療效，也有研究顯示局部應用前列腺素E2、F2α及類似物增加毛發生長和黑素生成[5]。因此，阿司匹林應用于色素增多性疾病的治療具有良好的前景。同時，阿司匹林對黑素生成的研究將為其治療色素增多性疾病提供實驗依據，為其進一步推廣奠定基礎。

[參考文獻]

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[收稿日期]2011-12-26 [修回日期]2012-02-16

編輯/張惠娟