玉竹對UVB誘導HaCaT細胞損傷的保護作用

王業秋,陳巧云,張寧,井麗巍,祁永華

[摘要]目的：探討玉竹水提液對中波紫外線（UVB）誘導人皮膚角質形成細胞損傷的保護作用及其可能機制。方法：用64mJ·cm-2的UVB照射人皮膚角質形成細胞建立光老化細胞模型，以不同濃度玉竹提取物處理光老化細胞，羥胺法檢測細胞超氧化物歧化酶（SOD）活性，比色法檢測谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，TBA法檢測丙二醛（MDA）含量，酶聯免疫法檢測腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）分泌量。結果：UVB照射角質形成細胞后，SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，TNF-α、IL-6分泌量增加（P<0.01），玉竹水提液中（100μg·ml-1）、高（200μg·ml-1）劑量組能顯著提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，減少TNF-α、IL-6分泌（P<0.05或P<0.01）。結論：玉竹水提液可在一定程度上減輕UVB對角質形成細胞的損傷，其機制可能與其抑制氧化損傷，增強細胞抗氧化能力，減少炎癥細胞因子分泌有關。

[關鍵詞]玉竹；UVB；HaCaT細胞；保護作用

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）04-0599-03

Protective effects of yuzhu on hacat cells damaged by ultraviolet B

WANG Ye-qiu,CHEN Qiao-yun,ZHANG Ning,JING Li-wei,QI Yong-hua

(Institute of Traditional Chinese Medicine &Cosmetology,Faculty of Jiamusi,Heilongjiang University of Chinese Medicine, Jiamusi 154007,Helongjiang,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effect of water-extract solution of Yuzhu on HaCaT cells injured by irradiation of ultraviolet B and its possible mechanisms.MethodsCell photoaging model was established by irradiating HaCaT cells with UVB(64mJ·cm-2). HaCaT cells were treated with different concentration water-extract solution of Yuzhu. The activity of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase(GSH-Px),the content of malondialdehyde(MDA) were detected by biochemical assay, the secretion levels of TNF-α and IL-6 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsThe proliferation activity of HaCaT cells descended with the UVB irradiation, the activities of SOD and GSH-Px decreased, when the content of MDA, TNF-α, IL-6, were ascensive(P<0.01). But under the intervention at middle concentration(100μg·ml-1) and high concentration(200μg·ml-1) of water-extract solution of Yuzhu, the above changes induced by UVB irradiation were inhibited(P<0.05 or P<0.01).ConclusionThe water-extract solution of Yuzhu might inhibit the proliferation decreasing which induced by UVB. And its mechanism may have relationship with the ability of strengthening antioxidation, decreasing oxygen radicals and decreasing the secretions of proinflammatory cytokines.

Key words:Yuzhu;UVB;HaCaT cells;protective effects

隨著環境污染的日益嚴重，到達地球表面的UV日益增多，UV輻射對健康的危害已成為全球關注的重大環境與健康問題之一，有關UV輻射的機制和防治研究是目前的研究熱點。中藥以其獨特的優勢，在抗皮膚光損傷領域的研究工作得到廣泛開展，玉竹為百合科植物玉竹Polygonatum odoratum(Mill.)Druce的干燥根莖，現代藥理學研究表明玉竹具有抗氧化、清除自由基、提高免疫力、抗腫瘤等多種生物活性[1-3]。筆者以體外培養的人皮膚角質形成細胞（HaCaT）為研究對象，在體外成功建立UVB誘導HaCaT細胞光損傷模型，觀察玉竹水提液對UVB損傷HaCaT細胞的保護作用。

1材料和儀器

1.1 實驗材料：人皮膚角質形成細胞HaCaT（武漢大學細胞中心），MEM培養基（Gibco公司），胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗（Billab公司），MTT（Sigma公司），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程公司），TNF-α、IL-6（研域(上海)化學試劑有限公司），中藥玉竹（北京同仁堂制藥集團哈爾濱分店，經本校陳效忠副教授鑒定為正品）。

1.2 儀器：紫外照射儀（Sigma公司），紫外線輻照計（北京師范大學光電儀器廠），Resecarch UV UF型超純水制備系統（上海和泰儀器有限公司），LDZX-4DSBI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠），IX-71-21PH型Olympus倒置顯微鏡（日本 Olympus株式會社），HF90型二氧化碳培養箱（上海智城分析儀器有限公司），MK3酶標儀（美國熱電公司），MS-500A半自動生化分析儀(美生科技有限公司)，MODUL YOD-230冷凍干燥儀（美國熱電公司）。

2實驗方法

2.1 藥物的配置：取玉竹100g加1000ml蒸餾水加熱煮沸1h，減壓抽濾后，濾渣加1000ml水提取兩次，合并三次濾液，濃縮成浸膏，經冷凍干燥制成粉末，保存于4℃冰箱中備用。實驗時取玉竹凍干粉用MEM培養液配成所需濃度，調pH值為7.0，0.22μm微孔濾膜過濾除菌。

2.2 HaCaT的培養：HaCaT細胞在含有10%胎牛血清的MEM培養基，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。取對數生長期的細胞以0.25%胰酶和0.02%EDTA消化，調整其密度為5×105個·ml-1，定量接種于12孔板。

2.3 細胞光老化模型的建立：參照文獻[4-5]的方法，將處于對數生長期的細胞接種于12孔板，待細胞單層貼壁后，棄培養液，每孔加入1ml PBS，使用64mJ·cm-2的UVB照射，空白組用鋁箔蓋住。

2.4 實驗分組：預實驗時設置50μg·ml-1、100μg·ml-1、150μg·ml-1、200μg·ml-1、250μg·ml-1、300μg·ml-1 6個劑量組做玉竹對正常HaCaT細胞的毒性作用實驗，發現250μg·ml-1、300μg·ml-1對HaCaT細胞有明顯毒性作用，因此正式實驗確定的玉竹最高劑量組為200μg·ml-1。

將處于對數生長期的細胞接種于12孔板，隨機分為空白組、模型組、玉竹水提液低（50μg·ml-1）、中（100μg·ml-1）、高（200μg·ml-1）劑量組。接種24h后各組棄培養液，每孔加入1ml PBS，除空白對照組外，按照2.3的方式造模。照射后棄去PBS，加入含藥的MEM培養基繼續培養。以上各組細胞每組設6個復孔。

2.5 檢測細胞中SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量：給藥24h后收集各組細胞，用冷PBS清洗2次，超聲破碎細胞，嚴格按照試劑盒說明書操作，檢測SOD活性，GSH-Px活性和MDA含量。

2.6 ELISA方法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6：給藥24h后收集各組細胞的上清液，按照ELISA試劑盒操作說明書檢測腫瘤壞死因子TNF-α和白介素IL-6的分泌量。

2.7 統計學方法：用SPSS13.0軟件對結果進行統計分析，多樣本間的方差分析采用LSD法，以P<0.05為差異有統計學意義。

3結果

3.1 玉竹水提液對HaCaT細胞SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量的影響：見表1。由表1得，與空白對照相比，模型對照組的SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型對照組相比較，玉竹水提液各劑量組均能提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量；且玉竹水提液中、高劑量組與模型對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。

3.2 玉竹水提液對HaCaT細胞分泌TNF-α、IL-6的影響：見表2。由表2得，與模型對照組相比較，玉竹水提液各劑量組均能降低TNF-α與IL-6分泌量；且玉竹水提液中、高劑量組與模型對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。

4討論

4.1 紫外線輻射是皮膚物理性損傷的主要因素，長期的紫外線輻射最終可導致光老化和皮膚腫瘤。波長短能量較高的UVB（290～320nm）主要作用于表皮，角質形成細胞是其靶細胞，UVB可以使角質形成細胞產生大量ROS，誘發氧化反應，引起一系列的氧化性損傷[6]，導致超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶含量下降，非酶自由基清除劑耗竭，過氧化最終產物丙二醛（MDA）等大量積累，而損傷的皮膚抗氧化防御體系會導致更多ROS的產生，以正反饋形式加劇皮膚組織和細胞的損傷。另外角質形成細胞在UVB輻射后可釋放多種介導炎癥反應、調節免疫應答和誘導細胞凋亡等生物學作用的細胞因子[7-9]。其中TNF-α是細胞因子網絡中心之一，可導致多種細胞因子的釋放，進而引起細胞凋亡，IL-6是角質形成細胞-成纖維細胞相互作用環路中的重要中介物質，其主要免疫學功能是加強其它細胞因子的效果。

中草藥對皮膚的光保護作用日益受到臨床的重視和應用[10]。傳統中藥玉竹用于抗衰老的歷史源遠流長，早在《神農本草經》就將其奉為上品，謂“久服，去面黑，好顏色潤澤，輕身不老”。現代藥理研究表明玉竹能抗氧化，清除自由基、抗炎等多種生物活性及藥理作用，說明玉竹具有抗皮膚光損傷的潛力，筆者的前期實驗證實玉竹對人皮膚真皮層的成纖維細胞具有很好的光保護作用[11]，本文從人表皮層角質形成細胞的抗氧化系統和細胞因子分泌來探討玉竹抗皮膚損傷的作用機理。

4.2 實驗結果表明，玉竹水提液低劑量組（50μg·ml-1）保護角質形成細胞免受UVB損傷的作用效果不明顯；中（100μg·ml-1）、高劑量組（200μg·ml-1）均能顯著提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，有效地對抗UVB對角質形成細胞氧化性損傷。同時玉竹水提液中高劑量組可以抑制UVB引起的TNF-α和IL-6的分泌來減輕紫外線引起的皮膚光老化及炎癥反應的發生。

綜上，玉竹可以通過多種途徑抑制紫外線對皮膚的損傷。本研究對防護紫外線產品的開發具有參考價值，可以為尋求天然防曬劑提供理論依據。

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[收稿日期]2011-11-22[修回日期]2012-02-10

編輯/張惠娟