火針治療對大鼠跟腱末端病HSP70表達的影響

史清釗　郭佳佳　張玉芹　方小芳

摘要：通過比較1次與4次火針治療后大鼠跟腱末端區HSP70表達變化，探討火針治療末端病的作用機理，為末端病的火針治療提供理論依據。采用“電擊跳躍法”建立大鼠跟腱末端病模型，并對模型進行火針治療。采用ABC法檢測HSP70表達，在40倍物鏡下進行陽性細胞計數。結果表明：治療1組纖維軟骨區、腱骨關節面軟骨的HSP70陽性率顯著高于對照1組 （P<0.05）；治療2組纖維軟骨區、腱骨關節面軟骨的HSP70陽性率顯著高于對照2組（P<0.05）；治療3組腱骨關節面軟骨的HSP70陽性率顯著高于對照3組（P<0.05）；治療4組腱骨關節面軟骨的HSP70陽性率顯著高于對照4組（P<0.05）；治療5組纖維軟骨區、腱骨關節面軟骨的HSP70陽性率非常顯著高于對照5組（P<0.01）。得出結論：1）1次火針治療誘導末端區合成大量HSP70，主要表現在纖維軟骨區、腱骨關節面軟骨2個部位，使末端區組織和細胞對壞死、損傷產生抵抗，同時促進壞死、損傷組織和細胞的修復，對末端病的恢復起到了一定的促進作用。2）4次火針治療后這2個部位的陽性率明顯高于1次火針治療，4次火針治療能更進一步促進末端病的恢復。

關鍵詞： 火針；跟腱；末端病；HSP70

中圖分類號： G 804.2文章編號：1009-783X（2012）04-0376-05文獻標志碼： A

末端病是指肌腱、韌帶、關節囊纖維層在骨上附著部分發生勞損性變性而引起的疾患^[1]。其發病部位多在四肢關節部位。例如，網球肘（肱骨外上髁炎）、肩袖損傷、跳躍膝、跟痛癥等。末端病屬慢性軟組織損傷，治療困難，且隨著競技體育和全民健身運動的發展，其發病率也呈逐年上升趨勢。火針具有行氣活血、溫通經絡和緩解炎癥的作用，對各種慢性軟組織損傷有顯著療效。經臨床驗證，用火針治療網球肘^[2-3]、肩周炎^[4]、跟痛癥^[5]等成功的病例已經有很多，且隨著施針次數的增加，恢復效果更明顯，至4次時已經基本痊愈，但涉及到作用機制的報道卻很少。

研究證實，HSP70是在高溫應激下合成最為迅速、表達最為豐富的一種蛋白^[6]。在末端病中，HSP70的表達可以保護受損組織和加速修復^[7-9]。火針療法是將針具在火上燒紅至發白發亮后快速刺入病體內，此時針身溫度可超過800 ℃，這種高溫產生的熱刺激，對于受損的末端區組織來說可作為一種應激原，可以誘導跟腱末端區發生熱休克反應，使HSP70合成增加。本文通過檢測火針治療大鼠跟腱末端病后末端區的HSP70變化，探討火針治療末端病的作用機制，為末端病的火針治療方法提供理論依據。

1材料與方法

1.1實驗設備

1）自制電刺激造模裝置（如圖1所示）：長55 cm，寬40 cm，高75 cm，其頂部完全沒有遮蓋；四周為光滑的有機玻璃，其底部為縱向排列的有一定間隔的銅棒，分別固定于木架上。電路兩端連接一個變壓器（調控電壓范圍在0～220 V）和一個帶有計數器、計時器及電路短路報警信號燈的數控裝置。在造模裝置底部通電，使2個銅棒之間有電壓，當大鼠的足部同時踩在相鄰的2個銅棒上時，通過大鼠足部的電流迫使其向上跳躍，雙足跳離銅棒即為有效跳躍。這樣使實驗動物完全模擬運動員的動作和訓練狀態，使造模結果與人體末端病更為接近。

2）細火針：購于北京中醫藥研究所。火針全長7.8 cm，柄長3.7 cm，直徑為0.40 mm。

1.2實驗對象及分組

1月齡雄性SD大鼠88只，體重（110±10）g。購于北京維通利華實驗動物中心，飼養于北京301醫院動物實驗中心，將大鼠隨機分為2個大組：安靜對照組8只和造模組80只。

1.3造模方法

大鼠造模訓練是參照姚小衛、扈盛等所確定的“電擊跳躍法”而進行的^[10-11]。正式實驗開始前，先進行3 d適應性訓練，每只每天20 min。正式實驗時，將治療組和對照組大鼠放在自制電刺激造模裝置內，一次8只。每15 s通電1次，持續20 min，休息10 min，再持續20 min。每天訓練1次，每周一至周六進行，周日休息，持續訓練8周。通電電壓逐步加大，直到大鼠出現有效跳躍為止，一般在50 V左右，個別情況下達到80～100 V。

1.4火針治療

將造模組隨機分為治療1、2、3、4、5組與對照1、2、3、4、5組，每組8只。其中，1～4組為1次火針治療組，5組為4次火針治療組。將大鼠固定，暴露其后肢，用酒精燈火焰燒細火針至發白亮，然后用火針于大鼠跟腱痛點處點刺，深度約為3 mm，分別對1次火針治療組，4次火針治療（1次/3d）組進行施針，每次治療只施針1次，每日治療均在09：00—10：00期間進行。

1.5取材及組織切片制作

1次火針治療組施針后于第1、2、3、4天分別處死治療1、2、3、4組及其相應對照組，并在第1 d處死安靜對照組取材。4次火針治療組在完成第4次治療3 d后進行取材。取大鼠單側后足跟腱和完整的跟腱末端區組織。將取下的組織分別放入10%甲醛固定液中，置于4 ℃冰箱保存24 h。之后用脫鈣液進行脫鈣，每3 d更換一次脫鈣液并搖勻，連續脫鈣5周。脫鈣完畢后將組織塊用自來水沖洗3 h后，然后上行酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。石蠟切片機切片，每個標本連續切片6～8張，切片厚度6 μm，用涂有多聚賴氨酸的載玻片附片，40 ℃烘烤2 h后室溫保存備用。

1.6測試指標及方法

1.6.1HE染色

檢測地點：中國科學院生態環境研究中心。常規HE染色。

1.6.2HSP70檢測

檢測地點：中國科學院生態環境研究中心。

采用ABC法進行HSP70的檢測，以及陰性對照實驗。HSP70檢測試劑盒：購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.7圖像采集及處理

1.7.1HE染色

HE染色后用Olympus BX-51顯微鏡在10倍和20倍物鏡下分別觀察跟腱末端區跟腱（T）、纖維軟骨區（UF）、鈣化軟骨區（MF）、跟骨（C）、腱骨關節面軟骨（CA）、腱圍組織（PT）的組織和細胞形態結構變化。

1.7.2HSP70檢測

光鏡下觀察細胞漿及細胞核中呈現出棕黃色顆粒的部位即為表達處。每個標本選取一張切片，觀察末端區跟腱（T）、纖維軟骨區（UF）、鈣化軟骨區（MF）、跟骨（C）、腱骨關節面軟骨（CA）共5個區域。最后在Olympus BX-51顯微鏡上觀察，每個區域觀察5個視野（不重復，不重疊），并在40倍物鏡下拍照，對每個視野進行陽性細胞計數，并計算HSP70陽性率（HSP70陽性率=5個視野內陽性細胞數之和/5個視野內細胞總數）。

1.8統計分析

所有數據用SPSS 13.0處理，數據結果用平均值±標準差（X±S）表示，經單因素方差分析進行組間差異比較。當方差齊性時，用LSD post-hoc檢驗；當方差不齊時，用Tamhane post-hoc檢驗。P<0.05代表顯著性差異，P<0.01代表非常顯著性差異。

2結果

2.1HE染色結果

安靜對照組大鼠跟腱主要由平行的腱纖維組成，呈波浪狀彎曲排列。在纖維束之間，有成行排列呈梭型的腱細胞，體積較小，中央有橢圓形的細胞核，細胞核大，占整個細胞的大部分，纖維軟骨區內Sharpey氏纖維相互交織成束。在Sharpey氏纖維之間，可見大量的軟骨陷窩，每個陷窩內有1～2個呈橢圓形的軟骨細胞緊挨在一起；潮線曲線平滑，其彎曲弧度與跟骨的輪廓基本一致；鈣化軟骨區與跟骨之間無明顯分界，染色均勻，細胞數目較少；跟骨骨小梁呈片狀，骨髓腔內有大量脂肪組織空泡；腱骨關節面輪廓清晰，邊緣光滑；腱圍內血管豐富，纖維輪廓明顯，排列不規則，細胞數目較多^[12]。

造模組大鼠末端區均出現明顯的末端病病理變化，與文獻報道一致^[12]。1）跟腱：對照組腱纖維出現排列紊亂，甚至斷裂，波浪狀彎曲消失，并發現多處呈紅染的玻璃樣變性區；2）纖維軟骨區：此區明顯增厚，遠側端出現明顯鈣化，潮線呈現“火焰”狀向纖維軟骨區漲潮；3）鈣化軟骨區和跟骨，染色不均勻，細胞數量不多，體積比纖維軟骨區的細胞大，細胞質豐富，基質中有時可見沉積巖樣的層狀排列；4）腱骨關節面軟骨：軟骨層明顯增厚，關節面輪廓模糊不規則，偶見炎性細胞浸潤；5）腱圍：水腫、增厚，血管輕度擴張，偶見炎性細胞浸潤。

2.2HSP70表達統計結果

安靜對照組大鼠跟腱末端區各部位未見明顯的HSP70表達，陽性個數、陽性率、平均灰度均為0。

與安靜對照組相比，造模組大鼠末端區在跟腱、纖維軟骨區、腱骨關節面軟骨3個部位的HSP70陽性率有非常顯著升高（P<0.01）。部分大鼠鈣化軟骨區、跟骨也出現少量陽性細胞，但與安靜對照組相比沒有顯著性差異（P>0.05）。

與對照組相比，治療組大鼠末端區主要在纖維軟骨區、腱骨關節面軟骨2個部位的HSP70陽性率有不同程度升高（如圖2、3、4、5所示）。其中：治療1、2組在纖維軟骨區、腱骨關節面軟骨的HSP70陽性率明顯高于對照1、2組，呈顯著性差異（P<0.05）；治療3、4組僅在腱骨關節面軟骨的HSP70陽性率明顯高于對照3、4組，呈顯著性差異（P<0.05）；治療5組在纖維軟骨區、腱骨關節面軟骨2個部位的HSP70陽性率明顯高于對照5組，呈非常顯著性差異（P<0.01）。而在跟腱、鈣化軟骨區、跟骨的HSP70陽性率比對照組雖有所升高，但均無顯著性意義（P>0.05），見表2、3。