抵抗素基因單核苷酸多態性與2型糖尿病的相關性研究

楊冰　劉忠民

[摘要] 目的 探討抵抗素基因rs34861192單核苷酸多態性與2型糖尿病的關系。 方法 分別測定2型糖尿病組（T2DM組）100例及正常對照組（CON組）150例空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FIN）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHOL）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-CH）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-CH）和抵抗素，并計算胰島素抵抗指數（IRI）；同時采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）技術對T2DM組和CON組進行抵抗素rs34861192位點基因型的檢測，根據結果進行綜合分析。 結果 T2DM 患者FBG、FIN、IRI、TG、抵抗素的檢測數值[分別為（9.96±5.86） mmol/mL，（12.23±9.21） μg/mL，6.25±4.13，（2.02±1.85） mmol/mL，（7.24±3.65） ng/mL]高于健康人群的檢測數值[分別為（4.94±0.50） mmol/mL，（5.63±2.66） μg/mL，1.24±0.62，（1.33±0.74） mmol/mL，（1.44±0.93） ng/mL]，差異有統計學意義（t值 分別為8.535，4.586，4.936，3.516，15.524，P均<0.05）；T2DM組和CON組抵抗素rs34861192位點的基因型分布分別為AA6%、AG40%、GG54%和 AA 0.7%、AG20%、GG79.3%；抵抗素基因rs34861192位點的基因型分布和等位基因頻率在T2DM組和CON組間有統計學意義（χ2值分別為20.231、19.103，P均<0.05）。 結論 抵抗素可能是T2DM的危險因子，抵抗素基因rs34861192位點多態性與2型糖尿病相關，同時可能對脂代謝有一定影響。

[關鍵詞] 抵抗素；基因多態性；2型糖尿病

[中圖分類號] R541[文獻標識碼] B[文章編號] 1673-9701（2012）21-0048-04

人的抵抗素基因存在多種單核苷酸多態性（SNP）現象，而SNP與2型糖尿病間的相關性，目前并無統一定論，可能與研究樣本的數量、病例及位點的選取有關，更可能與不同種族間的糖尿病易感性及個體差異有關。我們研究抵抗素水平和抵抗素基因rs34861192位點多態性與T2DM的關系，分析此抵抗素基因是否為2型糖尿病的易感基因，為2型糖尿病的早期預測、診斷、治療及預后提供分子生物學依據。

1材料與方法

1.1材料

儀器與試劑 ① 實驗儀器：質譜檢測儀（MassARRAY Analyzer Compact），點樣儀（MassARRAYNanodispenser），384 孔雙頭 PCR 儀（GeneAmp PCR System 9700 Dual 384-Well Sample Block Module），6mg 384純化板（SEQUENOM 公司），STAR全自動樣本工作站和FAME全自動酶標分析儀，羅氏cobase 411 全自動電化學發光免疫分析儀。 ② 主要試劑：通用基因組DNA提取試劑盒（廣州市達暉生物技術有限公司），iPLEX PCR反應試劑盒（SEQUENOM 公司），384-well SpectroCHIP 生物芯片（SEQUENOM 公司），HOTSTART Taq酶（SEQUENOM 公司），蝦堿性磷酸酶（SAP酶，SEQUENOM 公司），陽離子交換樹脂（SEQUENOM 公司），陽性質控YH（深圳華大基因研究院培育的“炎黃一號”細胞株DNA），抵抗素（RapidBio Lab Calabasaa），胰島素（Abbott Japan CO，LTD），葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯（中生北控生物科技股份有限公司），高密度脂蛋白膽固醇（日本第一化學藥品株式會社），低密度脂蛋白膽固醇（DiaSys Diagnostie Systems GmbH，德賽）。

1.2 對象

（1）正常對照組（CON組）：健康體檢的150例個體，無T2DM（均檢測空腹及餐后2 h血糖），無冠心病（無主述史并且心電圖無異常），體重指數（body mass index，BMI）<25kg/m2。（2）T2DM組：新診斷的T2DM患者100例（符合1999年WHO糖尿病診斷標準和亞太地區成人超重和（或）肥胖標準）：①糖尿病癥狀+任意時間血漿葡萄糖水平>11.1 mmol/L（200 mg/dl）；②空腹血漿葡萄糖（FPG）水平>7.0mmol/L（126 mg/dl）；③OGTT試驗中，餐后2 h血糖水平>11.1 mmol/L（200 mg/dl）。未用過胰島素，噻唑烷二酮類及其他口服降糖藥物，并排除繼發性2型糖尿病的可能。

1.3 方法

①樣本采集所有受檢者均隔夜空腹8 h以上，清晨抽靜脈血8 mL，其中一支EDTA-K2抗凝血2 mL，充分搖勻，徹底抗凝，作抵抗素單核苷酸多態性之用。兩支干燥管各注入3 mL血液，干燥管3 000 rpm/min離心15 min；一支分離血清，-20°C保存，用于抵抗素、胰島素檢測；另一支檢測基礎生化項目，包括空腹葡萄糖（FPG）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-CH）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-CH）。②基因分型按通用基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。由廣東省深圳市華大基因公司采用美國 SEQUENOM 公司的MassARRAY 時間飛行質譜技術（MALDI-TOF MS）完成對抵抗素SNP的基因分型。通過 PCR 擴增，SAP 酶處理，延伸引物單堿基延伸，樹脂除鹽純化，芯片點樣，質譜檢測等實驗步驟，最終使用 Typer 4.0 軟件分析實驗數據，獲得基因分型結果。③抵抗素的檢測 采用雙抗體夾心ELISA法。實驗儀器為STAR全自動樣本工作站和FAME全自動酶標分析儀。④空腹胰島素（fasting insulin，FIN）的檢測 采用化學發光技術即化學發光微粒免疫分析。實驗儀器為羅氏cobase 411 全自動電化學發光免疫分析儀。計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR），IRI=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。⑤其他生化指標的檢測空腹葡萄糖采用葡萄糖氧化酶法測定，總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇采用終點法測定，低密度脂蛋白膽固醇采用選擇性抑制直接法測定。

1.4 統計學方法

數據處理采用SASS17.0分析軟件分析。對每組數據進行正態性分析，FIN、TG、CHOL、HDL-CH、LDL-CH、IRI和抵抗素以（x±s）表示，兩組間變量比較采用獨立樣本t檢驗， P < 0.05為差異有統計學意義；變量之間相關關系分析先采用散點圖分析，有相關關系的趨勢變量再采用spearman進行相關分析；研究對象的基因型和等位基因頻率直接計算，群體符合程度用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，各組間基因型和等位基因頻率比較采用卡方檢驗，各基因型相對指標的比較采用單因素ANOVA分析，方差不齊采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 T2DM組與正常對照組的臨床特征

CHOL、HDL-CH、LDL-CH采用t檢驗，FBG、FIN、IRI 、TG、抵抗素在兩組間的差異性采用非參數秩和檢驗。結果發現，T2DM組與正常對照組的FBG、FIN、IRI、TG、HDL-CH及抵抗素差異有統計學意義（P ＜ 0.05），T2DM組的FBG、FIN、IRI、TG及抵抗素顯著高于對照組，HDL-CH顯著低于對照組，而兩組的CHOL、LDL-CH差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。見表1。

2.2抵抗素基因rs34861192的單核苷酸多態性

AA基因型（圖1），AG基因型（圖2），GG基因型（圖3）。

圖1 AA基因型

圖2 AG基因型

圖3GG基因型

2.3抵抗素基因rs34861192基因型在兩組人群中分布頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律

結果表明，本研究具有群體代表性。抵抗素基因rs34861192多態性的基因型頻率在T2DM組和正常對照組中差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。兩組間均以等位基因G為主，等位基因頻率的分布在兩組間差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。見表2。

2.4 T2DM組抵抗素各基因型間各檢測指標水平的比較

表3顯示，FBG、FIN、IRI、TG、CHOL、HDL-CH、LDL-CH及抵抗素在T2DM組內，rs34861192的不同基因型攜帶群體間差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。表4顯示T2DM患者抵抗素rs34861192位點 AA型基因攜帶者與G等位基因攜帶者比較，兩組的FBG、FIN、IRI、TG、CHOL、HDL-CH、LDL-CH及抵抗素水平均無統計學意義（P ＞ 0.05）。抵抗素rs34861192GG型基因攜帶者CHOL、LDL-CH明顯高于AG型基因攜帶者（P ＜ 0.05），見表5。

表5 T2DM組內各檢測指標的水平在各基因型攜帶人群之間的比較

3討論

抵抗素是一種由脂肪細胞分泌的新激素，由Steppan等[1]在研究抗糖尿病的新藥胰島素增敏劑噻唑烷二酮衍生物的作用機制過程中，在篩選小鼠體內誘導脂肪細胞分化基因時發現，因其與胰島素抵抗有關而命名為抵抗素。大量文獻報道，國外多數學者研究表明[1]，2型糖尿病患者有較高的抵抗素水平。近年來，國內學者研究抵抗素與2型糖尿病之間的關系比較活躍，大多側重于臨床研究，一部分研究者認為2型糖尿病患者血中抵抗素水平顯著高于正常組。

本研究對100例2型糖尿病患者和150例健康對照者的血清進行相關臨床參數測定后發現，2型糖尿病組與正常對照組間空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、抵抗素差異有統計學意義（P < 0．05），而兩組的總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇差異無有統計學意義（P > 0．05）。其中2型糖尿病組的空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數、甘油三酯及抵抗素顯著高于對照組，呈正相關，而高密度脂蛋白膽固醇呈負相關。本研究結果與黎銀燕[2]、陳江[3]、郝小林[4]的報道一致，表明2型糖尿病的發生可能與抵抗素水平的增高有關，并且血清抵抗素與糖尿病患者的胰島素抵抗指數呈正相關，提示可能是2型糖尿病患者體內增加的脂肪組織合成和分泌大量的抵抗素引起胰島素抵抗，使血糖水平升高，而高血糖又通過誘導脂肪組織對抵抗素的高表達，進一步加重機體對胰島素抵抗，從而最終導致糖尿病的發生。研究也證實抵抗素與血糖水平、甘油三酯和高密度脂蛋白相關，提示抵抗素不僅參與糖代謝還參與血脂代謝，可能抵抗素對能量代謝有更廣泛的影響。所以，我們認為抵抗素參與了胰島素抵抗過程和2型糖尿病的發病過程，并且與2型糖尿病密切相關。

抵抗素基因與T2DM的關系因多態性位點的部位和種類不同而有所不同，國內外學者對此也做了廣泛研究，當前，抵抗素基因-420多態位點與+299多態位點研究較多。NCBI數據庫上我們發現抵抗素基因rs34861192位點在國外人群中有一定突變率，而對于廣州地區人群該基因位點多態性的相關研究未見文獻報道。本研究檢測了100例2型糖尿病患者和150例健康對照者的抵抗素基因rs34861192的三種基因型分布，結果發現該位點SNP存在G→A的突變而呈現三種基因型： AA型、 AG型和GG型，在T2DM組和CON組內該位點的基因型分布分別為AA6%、AG40%、GG54%和 AA 0.7%、 AG20%、GG79.3%，該位點的基因型頻率在T2DM和正常對照組中差異有統計學意義（P < 0．05），并且等位基因頻率的分布在兩組間差異也有統計學意義（P < 0．05），提示抵抗素基因rs34861192多態性與T2DM發病有相關性，G等位基因可能通過活化抵抗素基因轉錄過程，增加抵抗素表達，降低胰島素敏感性，直接參與胰島素抵抗的發生。本研究還發現在T2DM組中，GG型基因攜帶者的CHOL、LDL-CH明顯高于AG型基因攜帶者（P < 0．05），提示通過基因變異疊加作用，純合子較雜合子的變異效能明顯增強，對T2DM的發病可能具有更大意義，表明G等位基因參與胰島素抵抗的發生，抵抗素基因rs34861192多態性可能對脂代謝有一定影響。

目前對于抵抗素是否聯系糖尿病的主要因素尚有爭議，其作用機制有待闡明，其研究還處于動物實驗及體外試驗階段，存在大量問題有待于進一步的研究與探討。

[參考文獻]

[1]Steppan CM，Bailley ST，Bhats，et a1． The hormone resistin links obesity to diabetes[J]． Nature，2001，409（6818）：307-312．

[2]黎銀燕，周強，羅淼珊，等． 2型糖尿病患者血清抵抗素的檢測及其與胰島素抵抗的關系[J]． 中華生物醫學工程雜志，2008，14（2）：145-147．

[3]陳江，姜東林，曹利民． 2型糖尿病患者血漿抵抗素和游離脂肪酸與胰島素抵抗關系研究[J]． 中國微循環，2006，10（1）：52-54．

[4]郝小林． 血清抵抗素與糖尿病的相關性研究[J]． 中西醫結合心腦血管病雜志，2010，8（8）：997-998.

（收稿日期：2012-05-24）