硒化殼聚糖促創面愈合作用的體內研究

鄧守恒 柯賢柱 楊敬寧 李芳 喻雄杰 陳萍

[摘要]目的：研究硒化殼聚糖軟膏促淺Ⅱ度燙傷小鼠創面愈合的作用。方法：147只昆明種小鼠隨機分為硒化殼聚糖軟膏治療組、基質治療組和京萬紅治療組，每組49只，采用將脫毛區置于70℃恒溫水浴中6s的方法制成10%體表面積淺Ⅱ度燙傷模型，傷情經病理切片證實。各組創面分別用硒化殼聚糖軟膏紗布（1ml/cm2）、基質紗布（1ml/cm2）、京萬紅紗布（1ml/cm2）覆蓋包扎固定后放回籠中飼養，換藥1次/天，觀察愈合時間，于傷后12h，第1、3、5、7和9天，分別處死各組小鼠7只，檢測含水量、羥脯氨酸、TNF、NO、ALT，另取7只做為正常對照。結果：①創面愈合時間：硒化殼聚糖軟膏組為（12.9±2.9）天、基質組為（16.3±2.1）天、京萬紅組為（11.8±2.4）天，硒化殼聚糖軟膏組比基質組明顯縮短（P<0.05）；②創面含水量：傷后第1、3、5天硒化殼聚糖軟膏組[（86.3±3.5）%、（77.8±3.9）%、（72.3±2.7）%]創面含水量顯著低于基質組[(92.8±3.2)%、（84.9±4.2）%、（77.2±2.8）%，（P<0.05）]，傷后7～9天，各組均基本恢復到正常水平；③創面TNF-α水平：傷后12h至1天達高峰，隨后逐漸下降，至傷后第5天仍高于正常對照組（P<0.05）；傷后12h、1天、3天、5天，硒化殼聚糖軟膏組和京萬紅組TNF水平明顯低于基質組（P<0.05）；④創面組織NO含量：傷后12h各燙傷組NO含量達高峰，隨后下降，至傷后第9天仍高于正常對照組（P<0.05）；傷后12h、1天，硒化殼聚糖軟膏組和京萬紅組NO含量明顯低于基質組（P<0.05）；⑤創面羥脯氨酸含量：傷后5、7、9天硒化殼聚糖軟膏組羥脯氨酸含量顯著高于基質組和京萬紅組（P<0.05）。結論：硒化殼聚糖軟膏能有效減少燙傷后早期創面組織NO和TNF-α釋放，減少滲出和水腫，晚期通過增強創面膠原合成來促進創面愈合。

[關鍵詞]硒化殼聚糖軟膏；淺Ⅱ度燙傷；羥脯氨酸；腫瘤壞死因子；一氧化氮

[中圖分類號]R644R332[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）01-0055-02

Effect of Selenium chitosan on wound healing in vivo

DENG Shou-heng1,KE Xian-zhu2,YANG Jing-ning3,LI Fang1,YU Xiong-jie1,CHEN Ping1

(1.Center of Oncology,People's Hospital,Hubei University of Medicine; 2.Department of Orthopedics, People'sHospital,Hubei University of Medicine; 3.Department of Immunology,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,China)

Abstract: ObjectiveTo investigate the effects of Selenium chitosan cream on wound healing of superficial second degree burn in rats.MethodsA total of147Kunming rats were randomly and equally divided into Selenium chitosan cream group 、ground substance group and JingWanHong group. Superficial second degree burn covering 10% of total body surface area was produced by immersing in 70℃ water for 6 second. The wounds were respectively covered with Selenium chitosan cream(1ml/cm2),ground substance(1ml/cm2),and JingWanHong(1ml/cm2). The rats were caged separately,and the dressings were changed once daily. The rats wound healing time were observed in all the groups.7 rats in each group were killed and the biopsies of wound tissues were taken on 12 hours and days1,3,5,7,9 after burn for the determination of water contents、hydroxyproline,NO,TNF,blood ALT and Crea .Another 7 rats were selected as control.Results①The time of wound healing was （12.9±2.9）days in Selenium chitosan cream group, （16.3±2.1）days in ground substance group,and （11.8±2.4）days in JingWanHong group respectively. The time for wound healing in Selenium chitosan cream group was significantly shorter than that in ground substance group（P<0.05）. ②The water content in the wound tissue in Selenium chitosan cream group on days 1,3,5 after burn[（86.3±3.5）%、（77.8±3.9）%、（72.3±2.7）%]was lower than those in ground substance group[(92.8±3.2)%、（84.9±4.2）%、（77.2±2.8）%，（P<0.05）]. During 7-9 days after burn, all of them returned to the normal level. ③The TNF-αlevel in wound tissue in each group reached the peak at 12-24h after burn,decreased thereafter, but it was still obviuosly higher than that of normal controls on 5 days after burn（P<0.05）. The TNF-α level in wound tissue in Selenium chitosan cream group and JingWanHong group were markly lower than those in ground substance group at 12h and 1、3、5d after burn（P<0.05）.④The NO content in wound tissue in each group reached the peak at 12h after burn,decreased thereafter, but it was still obviuosly higher than that of normal controls on 9 days after burn（P<0.05）. The NO content in wound tissue in Selenium chitosan cream group and JingWanHong group were markly lower than those in ground substance group at 12h and 1d after burn（P<0.05）. ⑤The hydroxyproline content in the wound tissue in Selenium chitosan cream group on days 5,7,9 after burn was higher than that in ground substance group（P<0.05）and in JingWanHong group（P<0.05）. Conclusion Selenium chitosan cream can accelerate wound healing by decreasing wound tissue NO and TNF-α release、enhancing collagen synthesis and lessening permeability and edema.

Key words: selenium chitosan cream; superficial second degree burn; hydroxyproline; TNF-α; NO

硒化殼聚糖[1]是將殼聚糖與亞硒酸在酸性條件下，以混合金屬離子為催化劑，通過拼合原理制備而成的有機硒，前期研究結果顯示，硒化殼聚糖可顯著促進體外培養的人皮膚成纖維細胞和表皮細胞增殖，且無明顯毒副作用[2-3]，這為進一步將硒化殼聚糖開發成促創傷愈合藥奠定了基礎。硒化殼聚糖軟膏是以硒化殼聚糖為主制備而成的軟膏劑[4]，為評價其體內作用效果，筆者在小鼠身上復制淺Ⅱ度燙傷模型，觀察了硒化殼聚糖軟膏用于治療燙傷的療效并探討了可能的作用機制。

1材料和方法

1.1 藥品試劑與儀器：谷丙轉氨酶（ALT）、L－羥脯氨酸試劑盒、一氧化氮（NO）、血肌酐（Crea）、腫瘤壞死因子（TNF）試劑盒（南京建成生物工程公司）；京萬紅軟膏（天津達仁堂制藥二廠，批號211556）；UV-Vis 9200分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；HH－2型數顯恒溫水浴鍋（國華電器公司）；Medal680酶標儀（美國Bio－Rad公司）；昆明種3月齡小鼠，我院實驗動物中心提供，許可證號SCXK（鄂）2006-2009。

1.2方法

1.2.1硒化殼聚糖軟膏制備：參見文獻[4]。

1.2.2動物模型制作[5]：參照文獻[5]方法將小鼠背部用8%的Na2S水溶液脫毛，脫毛后適應1天，禁食，乙醚麻醉，脫毛區放入70℃恒溫水浴中6s，制備10%淺Ⅱ度燙傷模型。造模成功以肉眼可見創緣環繞一白色邊界線，與創面周圍正常皮膚形成明顯的分界，病理切片見真皮乳頭層有明顯充血、水腫和白細胞浸潤，膠原纖維腫脹、離散。將燙傷小鼠隨機分為3組，即硒化殼聚糖軟膏組（A）、不含硒化殼聚糖固體分散劑和冰片的空白基質組（B）、京萬紅組（C），每組49只，另取7只小鼠不燙傷，作為正常對照組。

1.2.3給藥方法：各組小鼠分別外用硒化殼聚糖軟膏紗布（1ml/cm2）、基質紗布（1ml/cm2）、京萬紅紗布（1ml/cm2）覆蓋，包扎固定后分籠飼養，每日換藥一次。

1.2.4檢測指標：在傷后12h，第1、3、5、7和9天，分別處死各組小鼠7只，取標本檢測創面含水量、創面羥脯氨酸含量、創面組織TNF-α水平、NO含量和ALT活性，每組中所剩7只用于觀測創面愈合時間，即創面瘢痕完全脫落所需時間。創面含水量測定[6]：處死小鼠后，取創面組織約1g，稱重，放入80℃烤箱中，烘烤72h后稱重，組織含水量＝（濕重－干重）/濕重×100%。羥脯氨酸含量測定參見文獻[7]方法。TNF-α、NO、ALT按試劑盒說明檢測。

1.2.5統計學處理：所獲數據均以x±s表示，應用SPSS 13.0統計軟件進行方差分析，組間、組內比較采用ANOVA分析。

2結果

2.1 創面愈合時間A組小鼠創面愈合平均時間為(12.9±2.9)天，與B組平均時間16.3±2.1天明顯減少，有統計學意義（P<0.05）,與C組11.8±2.4天比較無差異（P>0.05）。

2.2 創面組織含水量各組小鼠燙傷后創面組織含水量均較空白對照組顯著增高，傷后12h達到高峰，其后開始下降。傷后第1、3、5天A組的小鼠創面含水量顯著低于B組（P<0.05），與C組比較無顯著差別（P>0.05），第7天以后各組小鼠創面含水量則沒有顯著差異,見表1。

2.3創面組織TNF-α水平各組燙傷后小鼠創面組織TNF-α水平均高于燙傷前的正常水平（P<0.05），傷后12h至1天達高峰，隨后逐漸下降，至傷后第5天仍高于燙傷前正常對照組（P<0.05），傷后第7天各組TNF水平基本恢復至正常。燙傷后12h、1天、3天、5天，A組和C組與B組比較，創面組織中TNF水平減少（P<0.05）；A組和C組比較，差異無統計學意義,見表2。

2.4 NO含量各燙傷組小鼠創面組織NO含量均高于燙傷前正常對照組（P<0.05,P<0.01），傷后12h達高峰，隨后下降，至傷后第9天仍高于正常對照組（P<0.05）。傷后12h、1天，B組創面組織NO含量明顯高于A組和C組（P<0.05），A組和C組創面組織NO含量各時相點比較均無顯著差異（P>0.05），見表3。

2.5創面羥脯氨酸含量燙傷后小鼠創面羥脯氨酸含量進行性增加，但從燙傷后第3天起，A組小鼠羥脯氨酸含量增加速度明顯加快，各對應時相點羥脯氨酸含量均顯著高于B組和C組（P<0.05）,見表4。

2.6谷丙轉氨酶水平 各組小鼠各時相點血中ALT活性與燙傷前相比較無顯著性差異（P>0.05），傷后各時相點A組ALT水平與B組和C組比較亦無顯著性差異（P>0.05）,見表5。

3討論

燒燙傷是臨床常見損傷，小面積燒燙傷主要采用藥物涂敷暴露或半暴露治療，由于臨床所用的促創面愈合外用藥多為膏劑，故將硒化殼聚糖加工成膏劑來評估其藥效較為合適。本研究以京萬紅為陽性對照，以制作硒化殼聚糖軟膏所用的基質為對照，觀察硒化殼聚糖軟膏對淺Ⅱ度燙傷小鼠創面愈合的影響，結果發現，在外用硒化殼聚糖軟膏后，燙傷小鼠創面愈合平均時間比基質組明顯縮短，創面水腫消退時間也快于基質組，說明硒化殼聚糖軟膏確實具有促創面愈合的作用。

已知炎癥反應全程參與了創面的損傷和修復，燒傷后創面組織細胞和炎癥細胞大量釋放炎癥因子引發局部炎癥反應，并同時啟動創面修復，使細胞進入增殖修復狀態， TNF是參與炎癥反應的主要炎癥因子之一[8]。本研究表明，燙傷后小鼠創面組織TNF顯著增加，但硒化殼聚糖軟膏組在各時相點尤其是在燙傷后3天內，均能顯著減少TNF的釋放，表明硒化殼聚糖軟膏可有效抑制創面組織中TNF等炎癥因子的過度合成和釋放，降低炎癥反應強度，減輕過度炎癥反應對創面的損傷。

組織損傷可誘導產生大量NO，高濃度NO作為一種前炎性細胞因子，能和超氧陰離子等反應，引發體內自由基的鏈式反應，還能促進炎癥局部多種細胞因子合成，從而引發瀑布式的炎性反應，直接和間接損傷組織細胞[9]。本研究顯示，燙傷可使小鼠創面組織NO含量顯著增加并持續較長時間，而硒化殼聚糖軟膏則能顯著減少NO含量，從而從源頭上減輕或抑制了炎性反應的發生。

膠原合成是創面愈合過程的重要環節，由于羥脯氨酸所占膠原的比例相對恒定，故測定羥脯氨酸的含量便可反映膠原的水平。本實驗中各組小鼠創面羥脯氨酸的含量隨著時間的延長均有增加，但第三天開始硒化殼聚糖軟膏組羥脯氨酸的含量就顯著高于基質組和京萬紅組，說明硒化殼聚糖軟膏有促進創面膠原合成的作用。

以上研究表明硒化殼聚糖軟膏在燙傷后早期能通過減少創面組織TNF和NO的合成和釋放，減輕炎性反應，阻止創面進一步加深和壞死對創面產生保護，后期則通過增強膠原合成來促進創面愈合，而對谷丙轉氨酶活性的檢測結果顯示硒化殼聚糖軟膏未對小鼠的肝功能產生明顯損傷，說明硒化殼聚糖軟膏確實是一種值得開發的治療燙傷外用藥。

[參考文獻]

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[3]鄧守恒,吳方毅,柯賢柱,等.硒化殼聚糖促表皮細胞增殖作用的實驗研究[J].中國美容醫學,2011,20(6):941-943.

[4]鄧守恒,曹風軍,連玉紅,等. 一種治療燒燙傷軟膏的制備[J].價值工程,2011,30(238):323-324.

[5]施新珗. 醫學動物實驗方法[M].北京:人民軍醫出版社,2002:102.

[6]Orgil D,De ming RH. Modern concept and approach to wound healing[J].Crit Care Med,1998,16(9):899-891.

[7]楊秀穎,杜冠華.組織經脯氨酸含量微量測定方法及應用[J].中國藥理學通報,2004,20(7):836-838.

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[9]鐘慈聲,孫安陽. 一氧化氮的生物醫學[M].上海:上海醫科大學出版社,1997:95.

[收稿日期]2011-08-08 [修回日期]2011-10-16

編輯/張惠娟