TNF-α對體外培養的人牙囊細胞增殖特性及堿性磷酸酶的影響

畢迎春 李蕓 金作林

[摘要]目的：檢測不同濃度TNF- 對體外培養人牙囊細胞增殖活性和堿性磷酸酶活性的影響。方法：第5代人牙囊細胞接種于96孔培養板上，分別與不同濃度的TNF- 共同孵育，檢測TNF-對人牙囊細胞的增殖活性和堿性磷酸酶活性的影響。結果：TNF-在濃度為10～50ng/ml，時間為3天時促進人牙囊細胞的增殖，濃度為10～200ng/ml時抑制堿性磷酸酶活性。結論：TNF-在特定的濃度和時間促進人牙囊細胞的增殖，抑制牙囊細胞的成骨特性。

[關鍵詞]牙囊細胞；腫瘤壞死因子－α；增殖；堿性磷酸酶

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）01-0071-03

Effects of TNF-α on the proliferation and alkaline phosphatase of the human dental follicle cells

BI Ying-chun1,Li Yun2,JIN Zuo-lin3

（1.Department of Stomatology,General Hospital of Jinan Military Area Command of Chinese PLA,Jinan 250031,Shandong,China;2.Department of Stomatology,210 Hospital of Shenyang Military Area Command of Chinese PLA；3.Department of Orthodontics,College of Stomatology,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China）

Abstract:ObjectiveTo study the effects of different concentration TNF-α on theactivity of proliferation and the activity of alkaline phosphatase of human dental follicle cells.MethodsThe 5th passage human dental follicle cells were seeded on 96-well plates and co-cultured with different concentration of TNF-α, the activity of proliferation and the activity of alkaline phosphatase was assayed.ResultsThe 10～50ng/ml TNF-α enhanced the activity of proliferation profoundly and the effects were significant at 3 days after co-culture. 10～200ng/ml TNF-α decreased the activity of alkaline phosphatase.ConclusionsTNF-α enhance the activity of proliferation and decreased the activity of alkaline phosphatase of human dental follicle cells at special concentration and time.

Key words:dental follicle cell; Tumor necrosis factor-α; proliferation; ALP activity

牙囊組織起源于外胚間充質，是包繞成釉器周圍的疏松結締組織，在牙齒萌出和牙周組織形成中起重要作用，缺乏牙囊的牙齒不能萌出，牙囊組織調節各種因子，如TNF-α、IL-10[1]、RANKLE等，吸引外周血中的單核細胞進入牙囊，融合成破骨細胞。TNF-α[2]第三天在大鼠牙囊中有微弱的表達，至第9天達到高峰，與第10天形成的破骨細胞高峰期有密切關系，TNF-α參與牙齒萌出的因子調節，是牙齒萌出過程中的重要因子。而TNF-α對人牙囊細胞的增殖的研究未見報道，這對TNF-α對人牙囊細胞生物學特性的影響有進一步的認識。

1材料和方法

1.1 主要試劑與儀器：DMEM高糖培養基(Hyclone，USA)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物材料有限公司)；胰蛋白酶(GIBCO公司，進口分裝)；TNF-α(Peprotech公司，USA)；96孔細胞培養板(NUCO，USA)；噻唑藍(MTT，Sigma，USA)；二甲基亞砜(DMSO，上海東風試劑廠)； 堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物試劑公司)；噻唑藍(MTT，Sigma，USA)； CO2細胞培養箱(Forma Scientific 公司，USA)；YJ-875型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；DG-3022型酶聯免疫儀(南京華東電子儀器廠)。

1.2 人牙囊細胞的體外培養：取12歲因正畸需要拔除的下頜第三磨牙的牙囊組織,用含雙抗的PBS 液沖洗3遍,切成1mm×1mm×1mm的組織塊,離心收集組織塊,625U/ml膠原酶消化40min,離心900r/min×6min,收集細胞和碎組織塊加入0.5ml含10%新生牛血清的高糖DMEM 培養液(含雙抗),接種到6孔板上,37℃,5%CO2孵育,3h 后加入培養液,5天后更換,以后每3天換液一次。5～10天可見細胞從組織塊爬出,15～20天待細胞長至80%,用0.25%胰酶消化傳代,利用細胞對胰蛋白酶消化時間的不同,可排除上皮細胞的混雜,達到純化牙囊細胞的目的,約傳代2次即可純化細胞。取3～6代細胞用于實驗。

1.3 TNF-α對體外培養的HDFCs增殖的濃度效應：取第3～6 代人牙囊細胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，配成單細胞懸液，以每孔1 000個細胞接種到96孔板上，每孔加5%FBS的DMEM 200μl，次日去除未貼壁死細胞，換含1% FBS 的DMEM培養液，同時分別加濃度為5、10、25、50、100、200ng/ml的TNF-α，對照組不加IL-1α，每組4 孔，第4天終止培養，每孔加MTT溶液20μl(5mg/ml)，37℃繼續孵育4h，終止孵育，小心吸棄培養液，每孔加150μl DMSO，振蕩10min、490nm 波長處酶聯免疫儀上測各孔光吸收值，記錄結果并進行方差分析。

1.4TNF-α對體外培養的HDFCs增殖的時間效應：按1.3的方法準備細胞，換含1% FBS 的DMEM 同時加空白對照組，實驗組加入TNF-α10ng/ml分別在1、3、5、7天 終止培養，每組4孔，每孔加MTT溶液20μl(5 mg/ml)，37℃繼續孵育4h，終止培養，吸棄培養液，每孔加150μl的DMSO，振蕩10min，490nm 波長處酶聯免疫儀上測各孔光吸收值，記錄結果并進行t檢驗。

1.5 TNF-α對體外培養的HDFCs的ALP的影響： 取生長良好的第5代人牙囊細胞用2.5g/l 的胰蛋白酶消化后，用含50ml/l FBS 的DMEM培養液配成單細胞懸液，以每孔103細胞接種到96孔板上，每孔體積為200μl，次日去除未貼壁死細胞，換含10ml/l FBS 的DMEM培養液，加入TNF-α濃度分別為0、5、10、25、50、100、200ng/ml，每組8孔，每3天 換液一次。于加液后5天 終止培養，其中4孔用作MTT檢測細胞增殖，另4孔用pH7.4的PBS洗3遍吸干，每孔加入1ml/L Triton X-100 50μl，置4℃冰箱過夜，然后加入堿性磷酸酶底物，每孔100μl，37℃孵箱內置30min，以0.2mol/L NaOH 50μl/孔，終止反應，在酶聯免疫檢測儀上在410nm波長處測各孔A值，計算ALP/MTT的比值(A410/A490)間接反映細胞堿性磷酸酶活性，采用單因素方差分析進行統計學處理。

1.6 統計學分析：所有計量資料均以x±s表示，采用SPSS10.0軟件進行統計分析，與對照組之間差異比較P＜0.05有統計學意義。

2結果

2.1 TNF-α對體外培養的HDFCs增殖的濃度效應：TNF-α對牙囊細胞的增殖具有輕度促進作用，在10ng/ml時對牙囊細胞開始有促增殖作用，在50ng/ml時達到最高峰(P<0.05)，當濃度增大至100ng/ml時，對牙囊細胞的增殖無明顯促進作用(P>0.05)(見表1)。

2.2 TNF-α對體外培養的HDFCs增殖的時間效應：選用10ng/ml的TNF-α，僅在第3天對牙囊細胞的增殖具有明顯的促進作用(P<0.05)，在的5天和第7天促增值作用不明顯，與對照組無明顯差異(P>0.05)(見表2)

2.3TNF-α對體外培養的HDFCs的ALP的影響：見表3，可看出，TNF-α對體外培養的HDFCs的堿性磷酸酶的表達有抑制作用，在濃度大于10ng/ml時，與對照組(濃度為0ng/ml)有顯著性差異(P<0.05)。

3討論

細胞增殖是檢測外界因素對細胞生物學效應的一個重要手段，它反映了細胞在受到外界環境因素作用后，自身發生變化的情況。TNF-α在牙齒萌出過程中具有重要作用，是調控牙齒發育和萌出的細胞因子，本實驗中發現TNF-α在濃度為10～50ng/ml時具有促進HDFCs增殖的作用，在時間效應的實驗中，10ng/ml的TNF-α在第三天時具有促進增殖的作用，隨后5天、7天的作用并不明顯，說明過高的因子濃度并不能引起相應的細胞增殖，也說明了細胞對某種因子的敏感濃度有一定的范圍，超過這一范圍，細胞將不敏感，甚至有毒副作用，引起細胞狀態不佳甚至死亡。

TNF-α對人牙囊細胞的增殖的研究未見報道，但TNF-α在大鼠的牙囊組織中有表達[2]，且與牙齒萌出過程中的破骨細胞的形成有關，因而推測某種濃度范圍內的TNF-α對牙囊細胞有促增殖作用，以往的研究也證實TNF-α可以促進成纖維細胞的增殖[3]，而牙囊細胞來源于外胚間充質，具有成纖維細胞的特性，二者的生物學特性有某些相似處。

堿性磷酸酶(ALP)是參與骨等硬組織形成、代謝、再生的重要調節物質，又是細胞分化成熟和成骨能力的標志之一， 堿性磷酸酶是與鈣化組織形成密切相關的一種物質，是向成骨細胞和成牙骨質細胞分化的標志。堿性磷酸酶廣泛分布于體內幾乎所有器官，是骨形成所必需的酶，通過水解磷酸酯、破壞礦化抑制劑及作為鈣結合蛋白和磷酸基的轉運子而促進礦化，作為生物礦化和成骨樣細胞的特征性標記。它的表達代表骨形成狀況，表明細胞分化的開始，并隨細胞分化的發展而增強，其活性的高低可反映相應細胞向成骨方向轉化的趨勢。

本實驗所采用的ALP活性檢測法是利用ALP可催化對硝基苯磷酸鹽水解為對硝基苯酚和磷酸鹽，而產生可間接反應ALP活性的對硝基苯酚的量，與在410nm波長測得的A值呈正相關。

牙囊細胞源于外胚間充質，是具有多向分化潛能的細胞群，含有發育成牙周組織的前體細胞。Handa等[4]通過體外培養牛牙囊細胞并提取RNA進行RT-PCR檢測，結果表明，細胞表達低水平的堿性磷酸酶。王湞等[5]在體外培養的人胚胎牙囊細胞中檢測到堿性磷酸酶mRNA的低水平表達。張永寬[6]等用礦化液處理牙囊細胞后，ALP的活性增強，Zhao M等[7]的研究表明體外培養的永生化的鼠牙囊細胞在rhBMP-2誘導下可以向成骨細胞/成牙骨質細胞表型分化， rhBMP-2能增強骨鈣蛋白、骨涎蛋白的表達，說明牙囊細胞具有向成骨樣細胞分化的潛能。Morsczeck[8]等 用地塞米松和胰島素誘導牙囊細胞向成骨樣細胞分化，骨鈣蛋白的表達增強，以上研究結果表明牙囊細胞具有一定的成骨特性。

TNF-α是一種炎癥介質，在體內有多種生物學活性，包括誘生其它細胞因子，調節血管內皮細胞性能，誘導抗病毒活性、血管生成和成纖維細胞生長等，近年來，研究發現TNF-α能促進破骨細胞的分化，促進骨吸收[9]。在前面的文獻回顧中我們提到TNF-α可抑制多種成骨因子的表達以及促進破骨因子的形成，ALP活性就是TNF-α抑制的因子之一。Nakase[10]等研究發現TNF-α可抑制成骨細胞中ALP的表達，并降低BMP-2、BMP-4引起的ALP的升高。Okabe[11]等研究發現TNF-α可降低牙髓細胞的ALP活性，并且這一作用通過NF- κB 和 Smad7信號途徑進行的，這一過程可減少繼發性牙本質的形成。本研究中TNF-α在大于10ng/ml時即可抑制ALP的活性(P<0.05)，說明TNF-α能抑制牙囊細胞的成骨特性，同時也說明牙囊細胞具有成骨和破骨兩種特性，在不同因子的作用下，牙囊細胞可表現不同的特性，也表明在牙齒萌出、發育過程中，成骨和破骨的發生是由多種因子共同作用發生的，可能引起牙胚冠方的骨質吸收，根方的骨質增生。其時間、空間的分布是非常復雜的，也是我們需要進一步研究的方向。

4 結論

本實驗采用不同濃度的TNF-α作用于體外培養的HDFCs，在濃度為10－50ng/ml可促進HDFCs的增殖，10ng/ml的TNF-α在第3天可促進HDFCs的增殖，說明TNF-α對HDFCs的促增殖作用存在最佳濃度和最佳時間。ALP活性的檢測證明：TNF-α濃度>10ng/ml可降低ALP活性。

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[收稿日期]2011-08-13 [修回日期]2011-10-26

編輯/張惠娟