放射治療兔耳增生性瘢痕的實驗研究

肇閱 張榮明 鐘瑞佳 黃超 邢爽 吳存剛

[摘要]目的：研究經過醫用高能電子線照射兔耳增生性瘢痕實驗模型后，觀察傷口愈合的情況、瘢痕愈合后的病理改變及肌動蛋白（ACTIN）和血管生長因子（VEGF）表達變化情況。方法：選用日本大耳白兔18只，在每只兔耳腹側面制作直徑6mm的圓形全層皮膚缺損創面10個。將總計360個缺損創面模型隨機分為6組，第1組為空白對照組（3只），其余5組為照射組（各3只）。將照射組每只兔耳隨機用200cGy、400cGy、600cGy、800cGy、1000cGy的6Mev電子線照射兔耳缺損創面,照射野周圍用鉛板防護，觀察兔耳缺損創面的愈合情況變化及創面愈合后瘢痕組織進展情況。并于致傷一個月后對實驗模型取材，進行光鏡、電鏡及組織學觀察。結果：兔耳腹側面圓形創面缺損，能產生與人類增生性瘢痕類似的增生塊。各照射組，缺損創面愈合延遲。總照射劑量相近的情況下，單次不同照射劑量對增生性瘢痕形成的影響有顯著性差異。結論：日本大耳白兔可以形成類似人的增生性瘢痕病理改變，可以用作增生性瘢痕研究的實驗動物模型。動物實驗證明，醫用6Mev高能電子線照射治療是一種有效的治療增生性癱痕的方法，總照射劑量相近的情況下，分5次照射、單次劑量400cGy，為最佳照射劑量。

[關鍵詞]增生性瘢痕；放射治療；膠原纖維；電子直線加速器；

[中圖分類號]R619+.6[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）01-0074-04

Experimental study of radiation therapy for hypertrophic scar in rabbits' ears

ZHAO Yue1, ZHANG Rong-ming2,ZHONNG Rui-jia3,HUANG Chao4,XING Shuang5,WU Cun-gang6,

(1.Studying for Master's Degree,The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical Univerisity, Jinzhou 121000,Liaoning,China;2.Department of Plastic Surgery,The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical Univerisity;3. Liaoning province EYE Hospital,Shenyang;4.Department of Stomatology,The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical Univerisity;5.Department of Ultrasound,The Third Affiliated Hospital of Liaoning Medical Univerisity;6.Department of Ultrasound,The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical Univerisity)

Abstract: ObjectiveThe study went through after the irradiation of high energy electronic wires which was conducted on the experimental model of hypertrophic scar of rabbits' ears. Observed the healing process and showed the pathological change as well as the variation of actin (ACTIN) and vascular endothelial growth factor (VEGF) after the healing of the scar.MethodsSelected 18 Japanese rabbits and made 10 models of circular full-thickness wound defects in the ventral side of per ear which each one was in the size of 6mm diameter. The total number of 360 wound defects was randomly divided into 6 groups. Group1 was the blank control group (3 samples), and the other 5 groups were the radiation group (3 samples in each group). Each wound defects on rabbits'ears was randomly irradiated with 200cGy, 400cGy, 600cGy, 800cGy, 1000cGy 6Mev electronic wires and the radiation field around was protected by the stereotype. Observed the change during the healing process and the progress of the scar tissue after the wound defects had already healed. Got the experimental material 1 month after the treatment injury and continued on the observations of the light microscopy,electron microscopy and histology.ResultsThe wound defects in the ventral side of the rabbits'ears could produce the similar hypertrophic scar like human beings. Each radiation group showed that the healing of the wound defects was delayed. Under the similar amount of the radiation, different volume of radiation per time could result a significant difference on the formation of the hypertrophic scar. ConclusionJapanese rabbits' could produce the similar pathological change of hypertrophic scar like human beings, and they could be the experimental animal model for the observation on pathological scar. This experiment proofed that radiation with 6 Mev pathological electronic wires is an effective way to cure the hypertrophic scar. Under the similar amount of the radiation, radiating 5 times fractionally which measured 400 Gy each time was the best quantities.

Key words:hypertrophic scar;radiotherapy;collagen fibers; electron linear accelerator

增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS），也稱之為肥厚性瘢痕，是臨床上常見的一種病理性瘢痕，其形成是由于創傷愈合過程中成纖維細胞合成與分解代謝紊亂，導致細胞外基質合成增多和過度沉積[1]。增生性瘢痕常發生在外科手術、外傷和燒傷后，不僅影響了美觀，而且會出現瘙癢、疼痛等癥狀，甚至能引起嚴重的功能障礙[2]。因此，對增生性瘢痕的治療成為了美容領域研究的重點和難點。雖然治療增生性瘢痕的方法有很多種，但是都達不到完全治愈的效果。增生性瘢痕的放射治療始于 1906 年，已有上百年的歷史。既可作為增生性瘢痕的首選治療模式，也可以作為外科手術的輔助治療方法。因為單純手術切除復發率高，據國外報道燒傷后增生性瘢痕的發病率達91%,手術后為40%～94%,與我國臨床報道相似[3]。而單獨二氧化碳激光治療后復發率也超過50%[4]。但由于相關的基礎研究較少，利用放射的方法治療瘢痕尚未達成統一的規范和標準，即影響了放射治療的效果，也增加了并發癥。而對于放射治療的最佳時間和合理劑量的確定，已成為研究的熱點之一。本研究擬采用醫用直線加速器產生的6Mev高能電子線，在總照射劑量相近的情況下，對兔耳增生性瘢痕模型，進行單次不同劑量和不同次數照射，尋求最佳單次照射劑量和照射次數，為臨床治療增生性瘢痕提供理論依據。

1實驗材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要實驗試劑 、儀器及來源見表1。

1.1.2 實驗材料：健康清潔級三四月齡日本大耳白兔18只，雌雄不限，體重范圍1.5～2.0kg，由遼寧醫學院實驗動物中心提供。

1.2方法

1.2.1 模型制作：選用18只日本大耳白兔的36個耳朵，耳緣靜脈3%戊巴比妥鈉（1.5mg/Kg）注射麻醉，麻醉生效后，剃去耳腹側兔毛，常規消毒鋪巾，在無菌條件下每只兔耳腹側面用自制打孔器制作直徑為6mm的圓形全層皮膚（深達軟骨膜）缺損創面10個，創面間隔1.5cm。各組實驗動物在喂養期間活動及進食水情況良好，均存活。共計360個缺損創面模型。每三只兔子為一組，隨機分為6組。其中1組作為對照組（60個創面），其余5組作為照射組，將照射組隨機編號分成200cGy組（A組）、400cGy組（B組）、600cGy組（C組）、800cGy組（D組）、1000cGy組（E組），每組60個創面。照射組術后立即采用醫用直線加速器產生的6Mev高能電子線照射兔耳腹側面創面。照射方案為：A組（2000cGy連續照射10天，每日一次，單次照射劑量200cGy）、B組（2000cGy連續照射5天，隔日一次，單次照射劑量400cGy）、C組（1800cGy連續照射3天，隔3日一次，單次照射劑量600cGy）、D組（1600c連續照射2天，隔5日一次，單次照射劑量800cGy）、E組（2000cGy連續照射2天，隔5日一次，單次劑量1000cGy）。創面采用暴露法，被照射創口周圍用鉛板防護。實驗動物模型制作一個月后，對照組和照射組均切取瘢痕組織，進行光鏡、電鏡及組織學觀察分析。

1.2.2 標本的處理：照射組取材范圍包括創口周圍部分皮膚及創面下部薄層肌肉組織。將標本組織置于4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，常規切片后行HE染色。電鏡標本按照實驗試劑盒所指示步驟制作后，行免疫組織化學染色。

1.2.3 免疫組織化學染色：常規石蠟切片脫臘和水化后，PBS（0.01M，pH7.4）漂洗3次，每次5min；3%H2O2去離子水孵育10min，枸掾酸鹽抗原修復液高溫高壓修復2min,自然冷卻至室溫后PBS漂洗3次，每次5min，去除剩余PBS液；滴加稀釋的一抗后,37℃孵育90min，PBS沖洗3 次，每次2min；去除剩余 PBS,滴加PV - 9000 試劑1(聚合物輔助劑)50μl,37℃孵育20min，PBS沖洗3次，每次2min；去除剩余 PBS,滴加PV - 9000 試劑2(辣根酶標記羊抗兔/鼠Ig G多聚體)50μl,37℃孵育30min，PBS 沖洗3 次，每次2min；每張切片滴加100μl新鮮配制的DAB溶液,顯微鏡下控制染色10min；蒸餾水沖洗，蘇木精復染1min，PBS沖洗返藍,梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，鏡下觀察,拍照。

1.2.4 統計分析：采用SPSS14.0統計學軟件，用χ2檢驗進行組間比較統計分析。P＜0.05有顯著性差異。

2結果

2.1 大體觀察情況：對照組的60個創面模型中，從第4天血痂形成，觸之易脫落、出血，未發現瘢痕形成；第8天時，血痂形成比較牢固，未發現瘢痕形成；第11～13天時，創面開始愈合，血痂自動脫落，顯露粉紅色瘢痕組織；術后第12天開始，瘢痕組織逐漸高出皮膚，呈現淡紅色，厚度約為兔耳厚度的1.5～2倍；術后30天時，60個創面，共形成增生性瘢痕48個，占80.0%，未形成增生性瘢痕12個，占20.0%。

2.2 不同照射方案對兔耳增生性瘢痕形成的影響：高能電子線照射組觀察增生性瘢痕變化的過程與對照組相同。創傷7天后，A組、B組實驗模型創面均無明顯感染跡象，創面收縮變小明顯；C組個別實驗模型創面出現感染，經過創口抗感染處理后，情況好轉；A、B、C3組實驗模型創面，平均14天后，創口開始愈合；D組與E組，實驗模型創面多處出現感染現象，傷口紅腫、化膿、腐爛，創口經過抗感染處理后，仍未見明顯好轉。D組與E組，照射劑量對創口愈合的副作用較大，所以該兩組的實驗模型未納入實驗研究。

照射組A組,術后30天時，共形成增生性瘢痕28個，占46.7%，未形成增生性瘢痕32個，占53.3%；B組術后30天時，共形成增生性瘢痕23個，占38.3%，未形成增生性瘢痕37個，占61.7%；C組術后30天時，共形成增生性瘢痕36個，占60.0%，未形成增生性瘢痕24個，占40.0%；將照射后各組形成增生性瘢痕的結果進行比較發現，不同單次照射劑量，形成增生性瘢痕的數量不同。各劑量之間比較見表2。

2.3 HE染色：光學顯微鏡觀察對照組1個月時瘢痕模型發現，表皮細胞層數較少，排列緊湊，上皮乳頭消失，真皮層明顯增厚，主要有大量的成纖維細胞增殖，成纖維細胞呈環形或旋渦狀分布。其間見有大量的膠原纖維，排列致密且紊亂。見圖1。

觀察6Mev高能電子線照射組1個月時瘢痕模型發現，膠原纖維排列較整齊，成纖維細胞數量及血管數量少于對照組，隨著照射量的增加，成纖維細胞的數量越少，膠原纖維也變的稀疏。見圖2～4。

2.4 不同照射方案對VEGF、ACTIN表達的影響：各組增生性瘢痕組織中VEGF及ACTIN的表達情況見表3、3。免疫組化發現對照組VEGF、ACTIN的表達水平顯著增高，表現為強陽性，照射組VEGF、ACTIN表達水平低于對照組，表現為陽性，見圖5～12，表4；同時A組與B組中VEGF的表達有差異，而B與C組中VEGF的表達無顯著差異。

3討論

3.1 自20世紀50年代以來國內外學者一直在為建立增生性瘢痕的動物模型進行探索。我們參照Morris[5],李薈元和邢幫榮[6-7]建立兔耳增生性瘢痕模型的方法，在兔耳腹側面成功建立了兔耳增生性瘢痕實驗模型。組織病理學證明，對照組HE染色，鏡下觀察發現，成纖維細胞大量增殖，深層呈水平向排列，淺層呈環形或旋渦狀排列，與人類的增生性瘢痕結構類似。而且創面愈合過程及增生組織的形成與人皮膚創傷后的愈合過程及增生性瘢痕形成有許多的相似之處。可能是因為兔耳腹側面肉膜結構缺乏，其皮膚結構與人的皮膚結構相近，所以能形成與人類似的增生性瘢痕。該實驗模型的建立，使檢測增生性瘢痕組織中ACTIN和VEGF的表達情況成為可能，同時也為臨床瘢痕的治療研究提供了依據。

3.2 增生性瘢痕常繼發于外傷、燒傷、燙傷、感染、耳環刺激、注射和手術后等。增生性瘢痕的發病機制涉及組織/器官、細胞、分子的各個環節，是一個錯綜復雜的相互作用、相互調控的過程，目前其具體機制仍不十分清楚[8]。增生性瘢痕的治療也十分棘手。增生性瘢痕常用的治療方法有有外科手術、激光療法、冷凍治療、放射療法、加壓療法、硅凝膠治療、藥物治療、中醫治療、基因治療等。目前國內多采用高能電子線近距離放射治療增生性瘢痕，但關于放射治療的開始時間、照射次數、每次照射劑量和總照射劑量、連續照射還是間隔照射，看法與觀點不一。主張術后早期照射的觀點國內外學者已達成共識，但何時開始照射效果最好，還未形成共識。本實驗采用不同劑量6Mev高能電子線分別照射5組實驗動物模型，大體觀察發現，D組與E組，實驗模型創面多處出現感染現象，傷口紅腫、化膿、腐爛，創口經過抗感染處理后，仍未見明顯好轉。由于D組與E組的照射劑量對創口愈合的副作用較大，所以該兩組的實驗模型未納入實驗研究。A組與B組比較發現，瘢痕數量、形態差異無顯著性，B組與C組相比較差異有顯著性。而在C組中，有個別的創面出現了感染現象，經過抗感染治療后情況好轉。由此可見，放射治療增生性瘢痕時，在一定范圍內不發生皮膚損傷的情況下，應加大單次照射劑量。故在本實驗中，400cGy的單次照射劑量治療增生性瘢痕餓效果更佳。

3.3 HS形成的病理過程跟創傷愈合的細胞增殖期各種活性因素有關。其瘢痕組織則是由大量不規則組織基質形成的成纖維細胞構成[9]。電鏡下觀察瘢痕標本發現，對照組有成纖維細胞大量增殖，呈環形或旋渦狀分布。其間可見大量的膠原纖維，排列致密且紊亂。照射組瘢痕模型標本中發現，膠原纖維排列較整齊，成纖維細胞數量和血管數量與對照組相比，明顯減少。這可能是因為直線加速器產生的6Mev高能電子線照射的結果，使膠原纖維的再形成過程中，減少膠原纖維的過度增生，抑制成纖維細胞的增殖，避免了增生性瘢痕的形成。

3.4 在瘢痕組織的表皮、真皮微血管、部分皮膚附屬器中VEGF表達增強，說明了在瘢痕組織中有新生血管形成。新生血管的形成為瘢痕組織的增生提供了營養基礎，可能在瘢痕組織的形成、發展過程中起著相當重要的作用。岳毅剛等[10]把不同濃度的VEGF單克隆抗體注射進裸鼠增生性瘢痕模型體內發現：VEGF抗體可以通過阻斷VEGF的作用，抑制膠原纖維合成和增生性瘢痕生長。瘢痕攣縮是由ACTIN為主要成分的微絲和鈣離子等構成的非肌性細胞收縮系統在起作用。在整個過程中，肌成纖維細胞是瘢痕攣縮的動力來源。增生性瘢痕抗纖維化的中心策略是抑制成纖維細胞的增殖與分化[11]。研究表明，任何非手術治療瘢痕有效的方法，都應該直接或間接針對抑制成纖維細胞增殖和調整膠原代謝異常這一重要環節[12]。

3.5 照射組各瘢痕模型中VEGF及ACTIN的表達降低，其中A組與B組、C組比較差異有顯著性，而B組與C組比較差異無顯著性。由此可以得出B組與C組放射治療效果較A組效果明顯。主要原因可能就是由于加速器產生的高能電子線照射后導致成纖維細胞壞死或凋亡，破壞膠原合成和降解的平衡所致。

3.6 經大規模多中心統計學調查顯示：合理放療并不會增加惡性腫瘤發生的可能[13]。綜上所述，治療增生性瘢痕時，在不引起皮損、使成纖維細胞壞死或凋亡并破壞膠原合成和降解平衡前提下，可以適當的增加6Mev高能電子線單次照射劑量，其最佳照射劑量為400cGy。

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[收稿日期]2011-08-11 [修回日期]2011-11-27

編輯/張惠娟