普通小麥鎘吸收基因Cdu1組成的功能標記檢測

張樂 陳為序 董慧 陳桂玲 余利 李興鋒

摘要：利用新開發的功能型共顯性分子標記usw47對86份供試普通小麥品種(系)的鎘吸收基因Cdu1組成進行了檢測和分析，結果表明：59個材料具有低鎘吸收型對應的375bp特異帶，占68.60％；27個材料具有高鎘吸收型對應的225bp特異帶，占31.40％。在47份小偃6號的衍生材料中，有74.47％的衍生品種(系)在鎘吸收基因Cdu1基因位點上與小偃6號一致，具有低鎘吸收型的優良等位變異；25.53％的衍生后代具有高鎘吸收型的等位變異類型。山東省近年選育的小麥材料中多數具有低鎘吸收型的特異條帶。

關鍵詞：小麥；鎘吸收基因；Cdu1；功能型分子標記

中圖分類號：Q754文獻標識號：A文章編號：1001-4942(2012)01-0006-05

鎘(Cd)是一種有毒金屬，以微量形式自然存在于幾乎所有的土壤中，被認為是最重要的重金屬環境污染物之一。農業、采礦業以及工業生產活動使大量的鎘進入環境中，并隨著污泥農用及污灌等進入農田生態系統，造成土壤鎘污染日趨嚴重。當鎘在土壤環境中含量達到或超過傷害閾值時，就會抑制作物根系生長，降低其光合作用和葉綠素含量，破壞作物體內保護酶系統，干擾碳、氮代謝及水分和養分吸收，使質膜透性加大等，表現出明顯的中毒癥狀，如植株矮小、葉片褪綠、生長遲緩等，嚴重影響作物產量。更為嚴重的是，鎘能夠在作物體內，特別是籽粒中大量積累，并通過食物鏈傳遞和富集，從而危害人體健康，日本的骨痛病就是鎘污染大米所致。含鎘食物，尤其含鎘谷物和蔬菜是人體內鎘的主要來源。因此，如何降低鎘在農作物中的富集受到廣泛關注。目前，聯合國糧農組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)的食品法規委員會已設定了小麥中鎘含量的標準值，為0.2mg/kg(CODEX STAN193-1995，2009)。

部分硬質小麥品種具有富集鎘元素使谷物中鎘水平超過上述標準值的基因潛力，該性狀由主效基因控制，該基因被定名為Cdu1，并被定位于5B染色體的長臂上。了解小麥品種Cd吸收的遺傳基礎及其基因組成，可以為選育低鎘吸收型品種提供理論依據。分子標記輔助選擇在育種中的應用越來越受到重視。ScOpc20是一個SCAR標記，已經被成功用于培育低鎘吸收型的小麥新品種，但由于它是一個與高鎘含量相關的顯性標記，因此限制了該標記在回交育種中的應用。Wiebe等(2010)開發了一個與作物鎘吸收性狀基因變異共分離的EST衍生標記(XBF474090)，該標記已經被成功轉化為一個共顯性CAPS標記，并被定名為usw47。在用限制性內切酶Hpyl88 I對PCR擴增產物進行消化之后，經電泳分析，該標記可用于檢測鎘吸收性狀基因的兩個等位基因，并成功將96個小麥品系分成低鎘吸收型或高鎘吸收型。因此，usw47在低鎘吸收型小麥新品種的選育中具有廣闊的應用前景。

本試驗利用鎘吸收基因Cdu1的功能型分子標記usw47對86份小麥材料進行檢測，旨在明確這些材料中鎘吸收等位基因的基因組成，同時分析探討了其中的小偃6號及其衍生系的鎘吸收基因的等位變異，以期為培育低鎘小麥品種奠定一定的理論基礎。

1.材料與方法

1.1試驗材料

所用材料共86份，見表1。其中1～52號包括小偃6號、其親本小偃96和鄭引4號、兩個姊妹系品種小偃4號和小偃5號及小偃6號的衍生材料，由中國科學院遺傳與發育生物學研究所李振聲課題組提供；中國春、J-11、IKE、Wx1D、江蘇白火麥、Chancellor、銘賢169為遺傳材料；60～86號材料為山東省近年育成品種，由山東農業大學農學院提供。所有材料在2009～2010年國家小麥改良分中心泰安試驗基地統一種植，田間常規管理。

1.2DNA的提取

每個品種選取幼嫩葉片5～6cm，經液氮冷凍后研磨成粉末，放入2ml離心管中，采用SDS一酚法提取小麥基因組DNA，并用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和質量，用于鎘吸收基因Cdu1位點的分子檢測。

1.3特異性標記

鎘吸收基因相關標記usw47序列參考網站http：//maswheat.ucdavis.edu/protocols/Cadmium/index.htm，所用特異性引物由上海生工公司合成，分別為usw47-F：5'-GCTAGGACTTGAT-TCATTGAT-3'，usw47-R：5'-AGTGATCTA-AACGTTCTTATA-3'。

1.4PCR擴增及酶消化

PCR反應體系均為20μl，含10×PCR buffer2.5μl，2mmol/L MgCl₂2μl，200mmol/L dNTPs1.5μl，每個引物1μl(約10ng)，基因組DNA 3μl(30～100ng)，TaqDNA聚合酶1U，其余由ddH₂0補齊。PCR擴增程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃復性30s，72℃延伸60s，35個循環；最后72℃延伸10min。

PCR擴增產物首先經Hpy 188I限制性內切酶消化，酶消化反應體系均為15μl，含PCR產物4μl，NEB Hpyl88I 0.25μl，NEB buffer4 1.5μl，ddH₂0 9.25μl。酶消化程序為：37℃反應1h；65℃酶變性20min；最后維持在10％。

消化產物采用6％～8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測，1×TE緩沖溶液，凝膠經硝酸銀染色，顯影后采用天能GIS凝膠圖像處理系統掃描成像。

2.結果與分析

usw47為共顯性標記，PCR產物經限制性內切酶Hpy l88 I消化后，電泳結果顯示出兩條差異帶，大小分別為375bp和225bp，分別對應低鎘吸收型等位基因和高鎘吸收型等位基因。此標記清晰易讀，重復性好，可用于檢測鎘吸收基因Cdu1位點上等位基因相應的類型。

本試驗所用86份小麥材料中，59份材料擴增出375bp的特異性條帶，為低鎘吸收型，占68.60％；27份材料擴增出225bp的特異性條帶，為高鎘吸收型，占31.40％(表1)。

小偃6號及其親本小偃96和鄭引4號、姊妹系小偃4號和小偃5號均擴增出375bp的特異性條帶，均為低鎘吸收型。47份小偃6號的衍生材料中，有35份材料擴增出375bp的特異性條帶，占74.47％；有12份擴增出225bp的特異性條帶，分別是白春5號、晉麥41、晉麥60、魯麥14、陜213、陜253、西農2258、小偃15、鄭麥9023、鄭麥9405、鄭農16、鄭優7號，占25，53％(表1)。部分小偃6號衍生材料的多態性檢測結果見圖1。

遺傳材料中國春、Chancellor、J-11、IKE、江蘇白火麥和銘賢169及山東省重要的小麥品種如

濟麥19、濟南17、山農15、臨麥2號、臨麥4號、濰麥8號、煙農19等擴增出225bp的特異帶，為高鎘吸收材料；而濟麥20、濟麥21、濟麥22和多數山農系列品種為低鎘吸收類型(表1)。部分遺傳材料及山東省育成品種的多態性檢測結果見圖2。

3.討論與結論

鎘是一種重要的環境和工業毒物，也是一種半衰期很長(長達10～35年)的多器官、多系統毒物，隨著人類生活生產活動，逐漸在土壤中及作物體內積累，不僅對農作物的生長發育、光合特性、產量、品質等理化性狀產生影響，而且可經食物鏈進入人體，嚴重影響人類健康。植物硫代謝、抗氧化系統和Cd²⁺跨膜運輸是植物對重金屬鎘響應的主要途徑。但，李妍發現，抗氧化酶未對鎘脅迫條件下的小麥幼苗起到明顯的保護作用。因此，分析作物的鎘耐受差異、緩解鎘對農作物的毒害、培育低鎘吸收型作物品種成為研究的焦點。小麥是我國北方地區的主要糧食作物之一，了解現有小麥品種鎘吸收的遺傳基礎及其基因組成，對培育低鎘吸收型小麥品種意義重大。

本研究利用鎘吸收基因的功能型分子標記usw47對86份小麥品種(系)進行分子檢測，結果表明，大多數材料(68.60％)具有低鎘吸收型所對應的等位變異。其中，小偃6號及其親本小偃96和鄭引4號、姊妹系小偃4號和小偃5號、35個衍生材料均為低鎘吸收型，說明骨干親本小偃6號具有低鎘吸收型的優良基因潛力，而其大多數衍生材料能很好地保存低鎘吸收型的優良基因等位變異。遺傳材料除WxlD為低鎘吸收類型外，中國春、J-11、IKE、江蘇白火麥、Chancellor和銘賢169均為高鎘吸收型，不宜用于低鎘吸收型小麥新品種的選育。

在27個山東省育成的小麥品種中，18個為低鎘吸收型，占66.67％；9個為高鎘吸收型，占33.33％。一些育成年限稍長的品種，如魯麥14、濟南17，多為高鎘吸收型；而大多數新育成的品種，如良星99、山農14、山農16、煙農23、煙農24、煙農25、濟麥20和濟麥21等，均為低鎘吸收型品種，說明這部分品種可以用作選育低鎘小麥的親本。值得注意的是山農14和山農15雖都是濟南17(高鎘吸收型)的后代，但一個為低鎘吸收型，一個為高鎘吸收型，這可能是由雜交組合的另一個親本不同造成的。

本研究僅是利用功能標記usw47對普通小麥的鎘吸收基因類型進行初步鑒定，對于鑒定出的低鎘吸收型小麥品種，還需通過土培和水培相結合的方法進一步驗證。隨著小麥基因組學研究的進展和研究技術的提高，將會有更多的功能標記被開發出來并用于準確檢測相關基因位點的等位變異。

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