轉Bt基因玉米葉片中Bt蛋白的表達和分泌研究

田曉燕 趙蕾 孫紅煒 李凡 趙輝 顏世磊 路興波

摘要：以轉Bt玉米Mon810及其親本非轉基因玉米為研究對象，通過酶聯免疫吸附測定法(ELISA)定量檢測Mon810玉米葉中Bt蛋白表達量和葉表Bt蛋白分泌量，結果表明葉組織和葉表均可檢測到Bt蛋白，組織內Bt蛋白量從苗期到抽絲期隨著植株營養生長的加快呈上升趨勢，至抽絲期達到頂峰，之后逐漸降低；葉表Bt蛋白分泌量變化無明顯規律性。

關鍵詞：酶聯免疫吸附測定法(ELISA)；轉基因玉米；Bt蛋白

中圖分類號：Q783文獻標識號：A文章編號：1001-4942(2012)01-0011-03

玉米螟(Pyrausta nubilalus)是我國玉米的主要蟲害之一，可危害玉米植株地上的各個部位，使受害部位喪失功能，降低籽粒產量，廣泛分布在北京、東北、河北、山東、廣西、四川等地，近年來危害日趨嚴重。

1990年美國Monsanto公司用基因槍法獲得了能正常結實的轉基因抗蟲玉米，使玉米自身能夠合成殺蟲物質，防治目標害蟲。種植轉基因抗蟲玉米可以減少化學殺蟲劑的用量和提高玉米產量，是防治玉米螟危害的有效手段之一，但是其對生態環境潛在的不利影響也不能忽視。國內外學者研究發現，轉Bt玉米的根系能夠向土壤中分泌CrylAb毒蛋白，而且該毒蛋白能很快與土壤基質結合，較之游離態更難被生物降解，對土壤微生物和生態造成影響。另外，有報道稱轉基因玉米花粉在一定的濃度下可以使黑鳳蝶存活率明顯下降，也有一些室內及田間試驗結果表明轉基因玉米花粉對非目標害蟲的存活率無顯著影響。本試驗在大田環境下對轉Bt基因玉米Mon810不同發育時期的Bt蛋白表達量及葉表Bt蛋白分泌量進行測定，旨在為轉基因植物的生態安全性評價和有效利用其抗蟲特性提供理論參考和依據。

1.材料與方法

1.1供試材料

供試玉米品種為孟山都公司的Mon810(品種為DK647BTY，表達CrylAb殺蟲蛋白)及其非轉Bt親本玉米DK647。2010年6月中旬播種，試驗田統一施肥和灌水，試驗期間不噴施任何農藥，其他管理措施同常規大田。在玉米的苗期、拔節期、喇叭口期、抽雄期、抽絲期、乳熟期和完熟期分別按照五點取樣法采摘充分伸展開的葉片；Bt-CrylAb酶聯免疫試劑盒購自美國Agdia公司。

1.2試驗方法

1.2.1葉組織Bt蛋白表達量的測定Bt蛋白的提取：2ml離心管加0.15g經液氮充分研磨的葉組織和1.5ml PBST提取緩沖液；渦旋使之充分混勻，靜置30min，離心10min(12000 r/min)，取上清液20μl，用提取液稀釋一定的倍數(50倍或100倍)待測。

Bt蛋白的定量測定：按照Bt-CrylAb酶聯免疫試劑盒說明的方法進行。加100μl樣品提取液于待測樣品孔中，保鮮膜覆蓋，200r/min振蕩15min，于保濕瓷盒中室溫孵育2h；用PBST緩沖液洗板，重復5次，之后每個微孔中加100μlCrylAb-enzyme conjugate，保鮮膜覆蓋，200 r/min振蕩15min，保濕瓷盒中室溫孵育2h；去膜，PBST緩沖液沖洗3次，每一個微孔中加100μl的底物，保鮮膜覆蓋，室溫孵育15min；最后加50μl終止液，充分混勻，30min內用酶標儀測定其450nm處的OD值，根據標準曲線求出Bt蛋白的含量，換算為每克鮮重含有的Bt蛋白量。

1.2.2葉表Bt蛋白分泌量的測定Bt蛋白的提取：先用無菌水將葉面輕輕沖洗3遍，將2.0g葉片和20ml PBST提取液放入錐形瓶中，200 r/min振蕩30min，靜置10min后取上清20μl，用提取液稀釋一定的倍數(50倍或100倍)待測。

Bt蛋白的定量測定：葉表Bt蛋白分泌量的測定方法同上。

1.2.3可溶性蛋白的測定采用考馬斯亮蘭G250法(Bradford法)測定，以牛血清白蛋白作為標準蛋白，分光光度計測定其OD₅₉₅值。

2.結果與分析

2.1不同生育期Mon810葉片中Bt蛋白表達量分析

對Mon810不同發育階段Bt蛋白表達量的測定結果(表1)表明，苗期～喇叭口期Bt蛋白表達量呈緩慢上升趨勢，不同生育期間無顯著差異；喇叭口期～抽絲期，Bt蛋白表達量顯著增加，至抽絲期達到最高峰，之后開始下降，完熟期Bt蛋白表達量顯著低于抽絲期(P<0.05)。

Bt晶體蛋白占可溶性總蛋白的量在一定程度上反映了不同時期植株Bt基因表達程度的強弱，可視為Bt基因的表達強度。從表1可知，Bt基因的表達強度于拔節期最高，隨后開始下降，抽絲期和乳熟期Bt基因的表達強度有所提高，完熟期又有所下降。

2.2不同生育期Mon810葉表Bt蛋白分泌量分析

由表1可知，從苗期到完熟期，Mon810葉面分泌物中均可檢測到CrylAb毒蛋白，分泌量在0.20-0.27μg/gFW，占Bt蛋白表達量的1.35％～2.20％，生育期之間無顯著差異(P>0.05)。乳熟期和完熟期的Bt分泌量略高于生育前期，葉片的老化可能是導致Bt分泌量增加的主要原因。

3.小結

本試驗結果表明，Mon810葉片中的Bt蛋白表達量隨著生育期進程而增加，至抽絲期達到最大，之后又開始下降。完熟期的Bt蛋白表達量顯著低于抽絲期，可能與株體的老化有關。Bt基因的表達強度在拔節期最高，乳熟期和抽絲期次之，推測表達強度的提高可以提高中后期玉米螟危害最嚴重時期的抗性。這與李蔥蔥等的研究結果相似。

國內外許多研究表明，Bt蛋白可與作物的根系分泌物一起被分泌到土壤中，本試驗的ELISA檢測結果表明，轉基因玉米亦可通過葉表分泌專一性Bt蛋白。但分泌量在整個生育期呈現不規律波動，原因可能有二：第一，Bt蛋白作為碳源和氮源被微生物降解利用，因此推測Bt蛋白不會在環境中長期積累；第二，大田試驗受很多自然因素的影響，葉表Bt蛋白量的波動可能與采樣前的氣候，如降雨量等有關。

需要指出的是，我們從陰性對照材料的葉組織內和葉表分泌物中都未檢測到Bt蛋白的存在，這說明我們的試驗結果是可靠的，可為轉基因作物的安全利用提供理論參考。