生姜根際姜瘟病拮抗菌的篩選及鑒定

徐瑩瑩 杜秉海 丁延芹 王翠翠 王璇 姚良同

摘要：從生姜根際土樣分離獲得了65個細菌分離物和42個放線菌分離物，通過離體拮抗試驗，篩選出對姜瘟病有良好拮抗效果的細菌一株，放線菌兩株，編號分別為H16－8、WFl和JW02－6。通過形態(tài)學觀察、生理生化測定以及16S rDNA序列分析，初步確定：H16－8為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)，WF1為弗雷德氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)，JW02-6為勞倫鏈霉菌(Streptomyces laurentii)。H16-8、WFl和JW02-6的16SrDNA序列的GenBank登錄號分別為：EU812754，FJ972686和FJ972687。

關鍵詞：生姜根際；姜瘟病；拮抗菌；篩選；鑒定

中圖分類號：S476⁺.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942(2012)01-0079-05

姜瘟病主要是由青枯假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)引起的。每年6～8月是該病發(fā)生和流行的高峰時期，此時北方正值高溫高濕天氣，是姜塊形成膨大旺盛期，病菌易侵入，侵染速度快，嚴重的可在半月左右造成全田無收，成為制約生姜優(yōu)質高產的毀滅性病害之一。篩選抗病品種、施用化學農藥等措施可防治姜瘟病的發(fā)生，但是輪作和篩選抗病品種周期長，使用化學農藥不僅不能從根本上防治病原菌，又帶來了環(huán)境污染。而生物防治既可限制病原菌青枯假單胞菌的生長，又增加了根際有益微生物的數量和抑菌物質的含量，是一種行之有效的方法。目前，雖然已有一些可防治姜瘟病的菌種被發(fā)現，但是大多存在著難以在生姜根際長期定殖的問題。

本研究討論的拮抗菌分離自生姜根際土壤，有利于其在根際的定殖，此外，拮抗菌的應用還可以有效地促進植株的生長。從山東萊蕪采集發(fā)病區(qū)生姜根際土壤樣品，篩選到對姜瘟病具有很好生防應用潛力的細菌1株，放線菌2株，其中H16-8被鑒定為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)，WF1被鑒定為弗雷德氏鏈霉菌(Streptomyces fra-diae)，JW02-6被鑒定為勞倫鏈霉菌(Streptomy-ces laurentii)。

1.材料與方法

1.1材料

生姜根際土壤樣品：采集自山東省萊蕪市。

供試病原菌：姜瘟病病原菌——青枯假單胞菌(Pseudomonas solanacearum)，由山東省萊蕪市農業(yè)科學研究院提供。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏一號培養(yǎng)基，馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基，細菌及放線菌菌種鑒定培養(yǎng)基參見文獻[12，13]。

試劑：分子生物學試劑購于寶生物工程(大連)有限公司，DNA小量快速純化試劑盒(3S SpinAgarose Gel DNA purification Kit)購于上海申能博彩生物科技有限公司。

1.2拮抗菌的篩選

分別采用細菌和放線菌培養(yǎng)所需的不同培養(yǎng)基，通過梯度稀釋法，從生姜根際土樣中分別獲得細菌和放線菌分離物。采用稀釋涂布平板法，即取100μl經12h培養(yǎng)的病原菌菌液涂布于拮抗篩選培養(yǎng)基平板上，再將待試菌接種于培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24-48h，通過觀察抑菌圈的有無及大小進行拮抗活性檢測，篩選出對姜瘟病病原菌具拮抗活性的細菌和放線菌，分別記錄其編號，并轉接到相應分離培養(yǎng)基斜面上保存。

1.3菌種鑒定

形態(tài)學特征、生理生化特性檢測及16SrDNA序列的擴增方法見參考文獻[13，14]。

1.4DNA提取和PCR反應

具體方法參閱文獻[15，16]，用相應的液體培養(yǎng)基接種拮抗菌，培養(yǎng)24h，收集菌液提取總DNA。

PCR反應體系為：Taq DNA聚合酶0.5μl，10×Buffer(Mg²⁺)2.5μl，dNTP(10mmol/L)0.5μl，引物1μl，模板1μl，ddH₂O補足至25μl。

反應條件：95℃5min；94℃1min；56℃1min，72℃1.5min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

用3S柱離心式瓊脂糖DNA小量，陜速純化試劑盒(3S spin Agarose Gel DNA purification kit)純化PCR產物。

1.5 16S rDNA序列測定及分析

16S rDNA的測序工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，序列相似性分析通過NCBI的BLAST程序比對(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，利用MEGA4.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Neighbor-Joining算法和Jukes-Cantor模型構建系統(tǒng)發(fā)育樹。自展次數設定為1000，自展檢驗結果低于50的數值不顯示在圖上。

2.結果與分析

2.1拮抗菌的篩選

通過梯度稀釋法從生姜根際土壤樣品中篩選出65個細菌分離物和42個放線茵分離物。經過初篩及復篩，獲得拮抗效果良好且穩(wěn)定的細菌1株，編號為H16-8；放線菌2株，編號為WF1和JW02-6。

從圖1中可以看出，H16-8、WF1和JW02-6都對Pseudomonas solanacearum具有較好的拮抗效果。

2.2形態(tài)學特征

H16-8的菌體大小為(0.50～0.55)μm×(1.10～1.20)μm，G⁺，短桿狀，產芽孢且孢囊膨大，在LB平板上培養(yǎng)24h后，菌落為微黃色，粘稠厚重，不透明，表面濕潤光滑，邊緣較規(guī)則。WF1孢子絲直或柔曲，孢子卵圓形或不規(guī)則圓形，表面光滑；JW02-6孢子絲直、彎曲，孢子卵圓形，表面光滑(圖2)。

2.3生理生化特性

菌株H16-8在牛肉膏蛋白胨和LB培養(yǎng)基上生長均形成微黃色不透明菌落，而在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上生長則形成乳白色粘稠不透明菌落；WF1和JW02-6的培養(yǎng)特性見表1。

H16-8、WF1和JW02-6的主要生理生化特性見表2和表3。其中，細菌菌株H16-8與其模式種在大多數生理生化指標上具有相同的特征，但在pH5.5及50℃條件下的生長情況與模式菌株性狀不符，說明H16-8更耐酸、耐熱。根據放線菌的分類和鑒定，WF1和JW02-6具有典型的鏈霉菌屬特征。其中，WF1與鏈霉菌屬弗雷德氏鏈霉菌的生物學特性相似，如弗雷德氏鏈霉菌可水解淀粉，使明膠液化和牛奶胨化，分解纖維素，硝酸鹽還原力強，不產生H₂S，但WF1不能分解纖維素，且兩者的碳源代謝不完全一致，弗雷德氏鏈霉菌可利用葡萄糖、果糖和蔗糖，而WF1僅能利用果糖。鏈霉菌屬勞倫鏈霉菌可水解淀粉，使明膠液化，可利用阿拉伯糖、果糖和甘露醇，而JW02-6能利用葡萄糖和木糖，不能利用甘露醇。篩選菌株與模式菌株之間的這些不同性狀，可能是菌株間確實存在差異，也可能是由菌株不

同生長環(huán)境造成的。

2.4 16S rDNA序列分析

PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像，如圖3所示。

經測序分析，由菌株H16-8、WF1和JW02-6總DNA擴增的16S rDNA序列長分別為：1413bp，1406bp和1400bp，將得到的序列提交GenBank獲得注冊號：EU812754、FJ972686和FJ972687。

如圖4所示，H16-8位于系統(tǒng)發(fā)育樹中短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)分支中，與Brevibacillusbrevis(AY887081)有較近的親緣關系。圖5則顯示菌株WF1和JW02-6都位于鏈霉菌屬(Strep-tomyces)分支中，分別與Streptomyces fradiae(AB184068)和Streptomyces laurentii(AB184669)有較近的親緣關系。

通過對其形態(tài)學、培養(yǎng)性狀及生理生化反應結果進行分析，可以初步判定拮抗細菌H16-8為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)，拮抗放線菌WF1為弗雷德氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)，JW02-6為勞倫鏈霉菌(Streptomyces laurentii)。

3.討論與結論

生物防治可作為解決土傳病害的一條有希望的途徑。利用拮抗菌防治植物病害已被認識和廣泛應用，從自然界尋找和篩選新的生防菌對生物防治具有重大意義。因此，利用拮抗菌防治姜瘟病具有廣闊的應用前景。

但一些實驗室表現良好的生防菌株在進行田間試驗時，出現拮抗效果不穩(wěn)定的現象，這主要與生防菌在作物根際的定殖能力、競爭作用及外界環(huán)境影響等因素有關。生防細菌防病效果取決于它在適當的時間定殖于適當的位置，并產生適量的抗菌物質，不同環(huán)境條件下生防細菌產生的抗菌物質的量不同。本試驗從微生物生態(tài)學角度出發(fā)，從生姜根際篩選得到了具有較好應用潛力的3個拮抗菌菌種資源短短芽孢桿菌H16-8，弗雷德氏鏈霉菌WF1和勞倫鏈霉菌JW02-6。目前關于植物細菌性青枯病的生物防治，國內外研究工作很多，但針對姜瘟病的研究則較少。同時，鏈霉菌可產生眾多次生代謝產物，已經成為重要的生防菌種而被廣泛研究。而本實驗也證明了兩株分別屬于弗雷德氏鏈霉菌和勞倫鏈霉菌的放線菌菌株對部分致病菌具有拮抗能力。

利用這些具有生防能力的菌株產生的次生代謝產物制備生物農藥，具有無污染、不易使有害生物產生抗藥性等特點。因此，本實驗所獲得拮抗菌可作為進一步研究姜瘟病拮抗菌拮抗機制的實驗材料，深入探討其生防機制及應用前景，促進高效低毒農藥的開發(fā)利用。

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