北京28號桃芽變株系的ISSR和SSR鑒定

摘 要: 品種鑒定是種質資源研究和新品種保護的基礎，研究在形態學鑒定的基礎上，通過ISSR和SSR標記，對3株北京28號疑似芽變材料及來自同一果園和不同果園對照未變異北京28號進行分子鑒定。結果發現，芽變株系在物候期及果實性狀上存在不同程度的變異，50對SSR標記中只有CPPCT022和BPPCT023在對照C2和其他供試樣品間存在不同等位基因位點；39條ISSR引物共擴增出314條DNA片段，其中 36 條具有多態性，多態性頻率為 11.46%；3株疑似芽變材料兩兩之間遺傳相似系數達到0.99，大于來自同一果園的兩對照C1和C2間的遺傳相似系數（0.96），說明3株疑似芽變材料應為同一芽變枝嫁接而來。通過UPGMA聚類分析發現，當遺傳相似系數為0.96時，3株疑似芽變材料與來自同一果園的兩對照未變異北京28號聚為一類群，且與對照C2親緣關系最為密切，結合表型分析，說明3株疑似芽變株系很可能是由對照C2芽變而來，而CPPCT022和BPPCT023有可能是其變異位點。

關鍵詞: 桃； ISSR； SSR； 芽變株系； 分子鑒定

中圖分類號：Ｓ６６2．1 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０12?雪０1－0024－０5

Molecular identification of peach bud sports from Beijing 28 with ISSR and SSR

SUN Shu-xia， CHEN Dong， LI Jing， TU Mei-yan， XIE Hong-jiang， JIANG Guo-liang*

（Horticulture Research Institute， Sichuan Academy of Agricultural Sciences·Key Laboratory of Horticultural Crops Biology and Germplasm Enhancement in Southwest， Ministry of Agriculture， Chengdu，Sichuan 610066 China）

Abstract: Molecular identification is important for the protection of new varieties and studies of germplasm resources. Of fingerprinting techniques， Inter-Simple Sequence Repeat （ISSR） and Simple Sequence Repeat （SSR） were among the most informative and powerful. In this study， we identified a peach mutation cultivar from Beijing 28 by ISSR and SSR based on the identification of phenotypic characters. The results showed that different variations of phenophase and fruit characters were observed in bud sports. The SSR primers could produce one or two discrete fragments in these accessions， and polymorphic bands were found between C2 and other samples in CPPCT022 and BPPCT023. Thirty nine ISSR primers amplified 314 bands， 36 bands were polymorphic， and the polymorphic percentage was 11.46%. The genetic similarity coefficient （GS） estimated from these molecular data ranged from 0.91 to 0.99， with an average of 0.95. The GS of three mutation accessions was 0.99 and of two controls from same orchard was 0.96. The combined grouping association indicated that these mutation accessions and two controls from the same orchard were clustered distinctly， and the genetic relationship was most closely between C2 and mutations. The three bud sports should be most likely from the control C2 combined the identification of phenotypic variation， and CPPCT022 and BPPCT023 might be the variation sites. These results provided valuable references for identification and protection of a new variety， classification and application of peach germplasm in commercial nurseries.

Key words: Peach； ISSR； SSR； Bud sports； Molecular identification

桃[Prunus persica （L.） Batch]起源于我國， 屬于薔薇科（Rasaceae）李屬（Prunus）桃亞屬（Amygdalus）植物，具有極其豐富的種質資源。經過長期的自然選擇和人工馴化栽培，已經形成眾多的品種和類型，據不完全統計， 全世界現共有3 000余個品種或類型，我國約有2 000余個[1]。芽變是變異體細胞進入芽的分生組織進而長出芽變枝，芽變枝通過嫁接表現出與原品種性狀有明顯差異，已成為無性繁殖產生新變異的源泉。芽變選種在育種中一直占有十分重要的地位，世界蘋果[2-3]、葡萄[4]和梨[5]等物種都存在大量變異品種。目前，對植物的芽變鑒定已由傳統經典的形態學鑒定發展到分子水平[6]。

近年來在桃遺傳多樣性方面做了很多工作[7-9]，但通過DNA指紋對芽變材料的分子鑒定還很少。根據共顯性SSR標記在同一位點能體現3種基因型（AA、aa、Aa），日本學者Yamamoto等[10]發現岡山白遺傳了所有的上海水蜜的SSR位點，很有可能就是上海水蜜的后代。沈志軍等[11]利用共顯性SSR位點遺傳規律分析發現早紅2號桃自交獲得紫金紅1號可能性很大，或至少是其親本之一。李莉等[12]通過RAPD標記鑒定，推測西妃是燕紅的芽變或者2者親本來源相同。

以上研究為桃芽變株系的分子鑒定奠定了理論基礎，SSR和ISSR標記是2種比較理想的遺傳標記，由于其操作簡單，重復性好，已成為當今應用最為廣泛的分子生物學技術。我們以表型性狀發生變異的3株疑似北京28號芽變株系及未變異的北京28號為供試材料，利用SSR和ISSR標記進行分析鑒定，旨在為新品種的分類、鑒定以及推廣提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與DNA提取

研究供試材料共有6份，包括3株疑似芽變單株（B1，B2和B3），2株來自同一果園的未變異北京28號（C1和C2），和1株取自附近果園未變異北京28號（C3）。該疑似芽變株系發現于成都市龍泉驛區茶店鎮，其物候期比北京28號提前10 d左右，在食用成熟度對果實品質性狀取樣分析。

供試材料分單株取樣，基因組DNA提取參照孫淑霞等[13]改良的CTAB法，并稍加改進。得到的DNA用1 mL TE溶解后再加入1 mL 65 ℃預熱的CTAB提取液，搖勻， 65 ℃水浴20 min，期間輕輕搖勻3次。冷卻后加入2 mL氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提純化。

1.2 引物篩選與PCR擴增

所用ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學UBC公司公布的第9套引物序列（Http://www.biotech.ubc.ca/ser-vices/naps/primers/Primers.pdf）；SSR引物[14-15]由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。以野生型和突變型基因組為模板，PCR反應體系及擴增程序參照Sun等[16]，對ISSR和SSR標記進行多態性分析。

1.3 數據統計分析

利用DPS軟件對芽變株系及其對照的果實品質數據進行t檢驗。比較將ISSR擴增產物以0、1、9統計建立數據庫。在相同遷移位置，有帶記為1，無帶記為0，擴增失敗或缺失數據記為9。利用NTSYS-pc統計分析軟件[17]計算遺傳相似系數（GS）。計算公式為：GS=2Nij/（Ni+Nj），其中Nij為材料i和j共有的擴增片段數，Ni為材料i中出現的擴增片段數量，Nj為材料j中出現的擴增片段數量。根據GS 值或者遺傳距離 GD（1-GS）按不加權成對群算術平均法（UPGMA）進行遺傳相似性聚類。

2 結果與分析

2.1 果實品質比較分析

北京28號系北京農林科學院林果所1973年在成都市龍泉山區試品種，栽培面積較大，頗受群眾歡迎。通過多年跟蹤調查，芽變株系除物候期比北京28號晚10 d左右外，植物學特征和生物學性狀都與對照相似。在食用成熟度果實的縱橫經、帶皮硬度、可溶性固形物、可溶性糖、可滴定酸和維生素C等品質指標都比未變異北京28號好。由表1看出，除可溶性糖外，其他指標差異分別達到極顯著或顯著水平。芽變株系生物學性狀及果實外觀都與北京28號相似，但總體果形較大，單果質量300 g左右，耐貯性好，風味口感比未變異北京28號也略勝一籌。

2.2 SSR和ISSR多態性分析

通過對95條ISSR引物篩選分析，選擇了其中39條擴增條帶明亮，重復性好的引物用于對疑似芽變株系和未變異桃北京28號鑒定分析。每條ISSR引物可擴增出5~12 條 DNA 片段，平均 8.05 條（圖1，表 2）。 39 條ISSR 引物共擴增出 314 條帶，其中 36 條具有多態性，多態性頻率為11.46%。這些多態性片段主要分布在250~2 000 bp，能有效地把疑似芽變株系與未變異北京28號鑒定區分開來。

在所分析的50對SSR標記中，有2對SSR引物CPPCT022和BPPCT023在芽變株系和對照間存在多態性（圖2），都是對照C2出現不同于其他供試樣品的等位基因位點，多態性頻率只有4%，這也從分子水平說明該疑似芽變材料與未變異北京28號基因組背景有很大的相似性，親緣關系很近，疑似芽變材料很可能是北京28號的變異株系。

2.3 ISSR 聚類分析

為更直觀地顯示ISSR標記檢測到的供試材料間的差異，對所獲6份材料（B1-B3為3株疑似芽變株系，C1-C3為對照未變異北京28號）314條譜帶進行聚類分析（表3，圖3）。結果表明，6份桃種質兩兩間的相似系數分布在0.91~0.99 ，平均值為 0.95。其中，來自同一果園的對照北京28號C1與C2間遺傳相似系數為0.96，B1與來自不同果園的對照C3間的遺傳相似系數最小為0.91，表明地域遠近與遺傳距離關系密切。疑似芽變株系B2與B3的相似系數最大，為0.99，表明2者的親緣關系最近，遺傳相似程度最高，應為相同材料。

從圖3可以看出，當遺傳相似系數0.96時，6份供試材料可分為1個類群和1個分支。3株疑似芽變株系和來自同一果園的2株對照未變異北京28號為一類群，來自不同果園的北京28號為單獨一分支。3株疑似芽變株系與同一果園對照未變異北京28號C2間遺傳相似系數較大，親緣關系更為緊密，說明3株疑似芽變材料很可能是由對照C2變異而來。

3 討 論

親本分析使用2種方法[11]，（1）親緣關系分析法，根據條帶有無統計1/0矩陣，用NTSYS軟件計算SM相似系數，UPGMA法進行聚類[17]；（2）共顯性標記遺傳規律分析法，因共顯性標記能區分顯性純合（AA）、隱性純合（aa）和雜合（Aa）3種基因型，根據同一位點共顯性標記的5種遺傳規律（即AA×aa=Aa，Aa×aa=Aa+aa，Aa×Aa=AA+Aa+aa，AA×AA=AA，aa×aa=aa），進行親本的推斷。本研究就是利用能很好揭示物種基因組遺傳背景的ISSR標記和有效分析親本關系的共顯性SSR標記，對果實品質性狀有明顯差異的芽變株系和對照北京28號進行分子鑒定，與前人研究相比有一定新意，研究手段也較為全面。

ISSR分析表明，對照C1和C2間遺傳相似系數并未達到99%，僅為96%，而不同果園的對照間遺傳相似系數更小（0.92），說明相同品種不同單株之間基因組背景并不完全一致，造成這種現象的原因可能有以下三點：首先就是與所選擇的分子標記本身有關，不同分子標記所擴增的基因組背景不同；同時也與選擇標記的數量息息相關，本研究所篩選到的ISSR引物數量較少可能是導致該現象的直接原因。接著就是與供試樣本地域來源及個體差異有關，最后可能與PCR擴增不穩定或非特異擴增有關，本研究所有條帶都重復擴增2~3次。

通過50對SSR檢測，只有對照C2在CPPCT022和BPPCT023標記上出現了與供試其他樣品不同的等位基因位點；ISSR分析則顯示3株芽變株系和對照C2間親緣關系最近，結合表型分析鑒定，說明該芽變材料有可能是來自同一對照C2的芽變株系，而CPPCT022和BPPCT023有可能是芽變位點，為桃優異種質的發掘與創新利用提供了理論參考。

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