ABA對葡萄花色苷合成相關基因表達的影響

摘 要：以京優葡萄為試材，研究果實成熟過程中果皮花色苷含量及其生物合成相關酶基因和轉錄因子轉錄水平的變化，同時研究不同濃度ABA處理對花色苷含量和相關基因轉錄水平的影響。結果表明，葡萄果實發育進入著色期，CHSs、CHIs基因家族中的CHS3、CHI2和UFGT、MybA1、MybA1-2隨花色苷合成而大量表達，其轉錄水平與花色苷合成緊密相關；ABA處理增加果皮花色苷含量的同時能夠提高花色苷合成相關基因的轉錄水平，并使其表達時期前移，ABA對CHS3和UFGT表達的促進作用最為明顯。相關性分析表明，花色苷含量與一些花色苷合成相關的結構基因（CHS3、CHI2、F3H2和UFGT），轉錄因子（MybA1）的轉錄水平呈顯著或極顯著正相關，與CHS1、CHS2、CHI1、F3H1、DFR、F3'H、LDOX和OMT的轉錄水平相關性均不顯著。

關鍵詞： 葡萄； ABA； 花色苷； 基因表達

中圖分類號：Ｓ６６3．1 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０12?雪０1－0029－０7

Effects of ABA on expression of genes related to anthocyanin biosynthesis in grapevine

YU Miao1，3， LIU Hai-feng4， WANG Jun1，2*

（1College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040 China； 2Center for Viticulture and Enology， College of Food Science and Nutritional Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083 China； 3Testing and analysis Center for Agricultural Product， Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences， Jiamusi， Heilongjiang 154007 China； 4Agricultural college of Yanbian University， Yanji， Jilin 133000 China）

Abstract: The Jingyou grape cultivars was used to study changes of anthocyanin contents， the transcription of anthocyanin biosynthesis enzyme genes and transcription factors during the fruit coloring period as well as the influence by ABA treatments of different concentrations. The results showed that the transcription of CHS3， CHI2， UFGT， MybA1 and MybA2 genes was closely related to the anthocyanin synthesis during the fruit coloring period and their expression increased as anthocyanin synthesis. Anthocyanin contents increased by the ABA treatment. Meanwhile， the transcription levels and expression time of anthocyanin biosynthesis relevant genes were also improved. The expression of CHS3 and UFGT was significantly improved by ABA. Correlation analysis showed that anthocyanin contents was significantly positively correlated with the expression of some structural genes （CHS3， CHI2， F3H2 and UFGT） and transcription factors （MybA1）， while there was no significant correlation between anthocyanin contents and the expression of CHS1， CHS2， CHI1， F3H1， DFR， F3'H， LDOX and OMT.

Key words: Vitis ssp.； ABA； Anthocyanin； Gene expression

葡萄果皮的著色程度是影響葡萄營養價值、食用質量和加工性質的重要因素[1]。果皮著色是花色苷合成和葉綠素降解綜合作用的結果。花色苷合成的種類、數量和時間決定了葡萄果實著色的程度和時期[2]。目前對花色苷合成和調控過程已經有深入的研究[3]，如圖1所示，葡萄的的花色苷生物合成途徑已較為清楚[3-5]，這個過程主要是苯丙氨酸生成4-香豆酸CoA，4-香豆酸CoA再和另一前體丙二酰CoA在花色苷合成相關酶的作用下通過類黃酮途徑最后生成穩定的花色苷[6]。其中一些花色苷合成的相關基因已被克隆，如CHS[4]，F3H[5]，UFGT[6-7]等，為從分子生物學水平研究花色苷合成提供了條件。葡萄果實花色苷的合成受一些環境和理化因素影響，例如：溫度、光照和植物生長調劑（ABA、乙烯利等）。 其中ABA 作為一種重要的成熟激素， 在躍變型和非躍變型果實的成熟過程中都起著重要的作用。利用ABA處理可以促進果實花色苷的合成已經在葡萄[8]和甜櫻桃[9]等主要果實中得到證實。但是研究ABA處理是如何調控葡萄果實花色苷生物合成途徑主要基因轉錄水平的研究甚少。我們以京優為試材，利用熒光定量PCR技術檢測葡萄果實著色過程中花色苷生物合成相關基因轉錄水平的變化規律和外源ABA對花色苷生物合成相關基因轉錄水平的影響，分析花色苷合成過程中花色苷合成與相關基因轉錄水平之間的關系。

1 材料和方法

1.1 材料與處理方法

京優葡萄采自東北林業大學林木遺傳育種實驗基地，砧木為貝達，5 a生植株。在植株坐果后人工疏花疏果，每結果枝留1~2穗，并按照葡萄園常規栽培管理措施進行管理。試材于2009年6月12日開花，在2009年8月25日（著色期前）選擇樹勢中庸，長勢一致的葡萄植株，用脫落酸（Abscisic acid）均勻噴淋果穗，設3個濃度，分別為A1：300 mg·L-1；A2：600 mg·L-1；A3：900 mg·L-1。同時用等體積的清水處理一組葡萄作為對照（CK），每個濃度處理3株。處理后每周取樣1次，取樣時用干凈紙巾拭去葡萄表面塵土后立即放入冰盒，帶回實驗室，-80 ℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 花色苷的測定 參照Boss等[8]的方法檢測果皮中花色苷含量，每個樣品重復3次，取平均值。

1.2.2 總RNA的提取和熒光定量PCR 根據Li等[10]的CTAB法提取葡萄果皮中的總RNA，以總RNA為模板，利用Takara Prime ScriptTM RT-PCR試劑盒反轉錄合成cDNA。根據Genbank中CHSs、CHIs、F3Hs、F3'H、F3'5'H、DFR、LDOX、OMT、UFGT、GST、VlmybA1、VlmybA1-2、18s rRNA和KyActin1的全長序列，利用Primer 5.0設計PCR引物（引物序列見表1），引物由上海生工合成。以cDNA為模板，18S rRNA 基因和Kyactin1基因作為內參，利用合成的引物進行Real-Time PCR擴增檢測相關基因的轉錄水平。PCR反應體系為50 μL：含有SYBR Premix Ex Taq （2×） 25 μL，上游引物和下游引物各1 μL，模板4 μL和19 μL去離子水。反應程序如下：94 ℃ 預熱30 s，94 ℃變性12 s，72 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸40 s，81 ℃ 讀板1 s（收集熒光信號），40個循環。以上反映程序結束后，再使溫度從55 ℃ 升至99 ℃，每升高0.2 ℃ 保溫1 s進行讀板，采集熒光信號，每個模板做3個平行，取平均值表示相應RNA的CT值。采用ΔΔCT法對熒光定量PCR擴增數據進行處理，目的基因的相對含量通過計算2-ΔΔCt值來確定。

1.2.3 數據分析 利用SPSS軟件分析花色苷含量和花色苷合成相關基因轉錄水平的相關性。

2 結果與分析

2.1 ABA處理對葡萄花色苷合成的影響

ABA處理對葡萄果皮中花色苷合成的影響如圖2和圖版，對照組葡萄果實在9月8日后開始著色同時有花色苷合成，并且含量緩慢增加，9月15日后果實明顯著色，花色苷含量急劇上升，一直持續到果實成熟，最大值達到0.651 A520·g-1（FW）。ABA處理可以顯著促進果實著色和增加花色苷含量，不同濃度ABA處理的花色苷含量隨著果實發育與對照間的差異增大，A2處理著色效果最好，在9月15日花色苷含量開始迅速增加，顯著高于對照，花色苷含量最大值是1.279 A520·g-1（FW），約是對照的2.5倍；A3處理在著色前期促進果實著色效果明顯，后期效果弱于A2處理；A1處理效果最差，但高于對照。

2.2 ABA處理對花色苷生物合成相關基因轉錄水平的影響

不同濃度ABA 處理對花色苷合成相關基因轉錄水平的影響如圖3，4所示，對照處理組隨葡萄果實發育進入著色期，花色苷合成相關基因上調表達，果實完全著色后，下調表達。由圖3可見，上游基因CHSs、CHIs、F3Hs、F3'H和F3'5'H在果實著色前期最先表達，轉錄水平迅速提高，著色中后期轉錄水平緩慢增加到最大值后下降。而且CHSs、CHIs和F3Hs各自基因家族每個成員的mRNA拷貝數存在顯著不同，CHSs基因家族中，CHS1在葡萄著色期表達較少，而CHS2和CHS3在著色期轉錄水平較高，大約是CHS1的6倍，CHS3的轉錄水平最高。果皮中含有2個CHI序列（CHI1和CHI2），2者均先下調表達，8月31日后上調表達，CHI1表達強，而CHI2表達弱。F3Hs基因家族中可以檢測到F3H1和F3H2，2者均上調表達，其中F3H2的轉錄水平大于F3H1，大約是F3H1的5倍。由圖4可見，下游基因DFR、LDOX和OMT在著色前期轉錄水平較低，著色中后期大量表達，轉錄水平迅速提高并且維持較高水平。UFGT在著色前期幾乎不轉錄，在著色中期轉錄水平迅速提高，在著色后期大量表達。轉錄因子MybA1和MybA1-2表達特征和UFGT相近，均上調表達，在著色中后期大量表達，果實完全著色后轉錄水平降低。

ABA處理能明顯提高花色苷合成相關基因的轉錄水平，并有使表達時期前移的作用（圖3，4），其中ABA處理促進CHS1、CHS2、CHI1和F3'H幾個基因轉錄水平提高的效果不顯著，只提高1倍左右，而顯著提高CHS3、F3H2、F3'5'H、OMT和UFGT幾個基因的轉錄水平，在ABA處理下，UFGT的轉錄水平在果實著色后期顯著提高并維持遠高于對照的水平。

結果表明，3種濃度ABA的處理都能不同程度的提高花色苷合成相關基因的轉錄水平，其中600 mg·L-1（A2）濃度處理效果最好，可以最有效的提高花色苷合成基因的轉錄水平，300 mg·L-1（A1）濃度的處理略高于對照，效果不明顯，900 mg·L-1（A3）濃度處理在果實著色前期促進花色苷合成相關基因表達的效果比較明顯，而在果實著色后期反而對基因表達起到一定抑制作用，效果和300 mg·L-1（A1）濃度處理相當，甚至低于對照。

2.3 花色苷合成相關基因轉錄水平和花色苷合成的相關性分析

葡萄果皮中花色苷含量與花色苷合成相關基因轉錄水平的相關性分析結果表明（表2，3），在果實生長發育過程中，果皮中花色苷合成相關基因的轉錄水平和花色苷合成具有一定的相關性，CHS3、CHI2、UFGT和MybA1與花色苷合成呈顯著和極顯著正相關，其中CHS3和MybA1的轉錄水平與花色苷合成相關系數最高，相關系數分別達到0.848和0.891。而CHS1、CHS2、CHI1、F3H1、F3H2、F3'H、DFR和LODX的轉錄水平與花色苷合成相關性不顯著。ABA處理促進花色苷合成的同時也提高了一些相關基因的轉錄水平，其中在A1處理下，F3'5'H和UFGT的轉錄水平和花色苷合成呈極顯著正相關，相關系數分別為0.901和0.914；在A2處理下，CHS3、F3'H、UFGT和MybA1的轉錄水平和花色苷合成呈極顯著正相關，相關系數分別為0.935、0.925、0.969和0.844；在A3處理下，CHS3、UFGT和MybA1的轉錄水平和花色苷合成呈極顯著正相關，相關系數分別為0.932、0.964和0.912。

3 討 論

近年來葡萄果實著色的研究不僅集中在花色苷種類和含量上，同時拓展到分子生物學水平。Boss等[11]研究發現在黑皮葡萄Shiraz成熟過程中有7種花色苷合成相關基因（PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、LDOX 和UFGT）持續表達。果實進入著色期隨花色苷積累，果皮中7種花色苷合成基因上調表達。Northern雜交分析表明，UFGT只在有花色苷積累的果皮中表達，而除UFGT外其他基因的表達貫穿整個著色期，在花后2~4周的果皮中沒有花色苷積累，也能檢測到它們的表達。在自然條件下，UFGT只在紅色葡萄著色后期的果皮中表達，而在白色葡萄和果肉中不表達[8，11]。另外研究發現外施ABA可以提高葡萄果實花色苷的含量和加快果實成熟[12-15]，內源ABA的含量與花色苷的積累緊密相關，這可能由于ABA促進花色苷生物合成途徑相關基因的表達。最近研究表明，在轉色期ABA處理Kyoho葡萄可促進其花色苷的積累和果皮中CHS、CHI、DFR、LDOX和UFGT的表達 [13-14]。本研究中花色苷合成相關基因進入著色期后轉錄水平顯著提高，隨花色苷的合成上調表達，到果實成熟后下調表達。果實進入著色期ABA處理明顯促進花色苷合成相關基因CHS3、CHI2、F3'H、F3'5'H、LDOX、UFGT和MybA1的轉錄，轉錄水平皆明顯高于對照，尤其是CHS3、UFGT 的轉錄水平顯著提高并維持在遠高于對照的水平。以上結果與Ban等[14]的研究結果類似，說明ABA可以提高葡萄果皮中CHS3、CHI2、F3'H、F3'5'H、LDOX、 UFGT和MybA1等花色苷合成相關基因的轉錄水平的轉錄水平，從而促進花色苷和合成，提高果實中花色苷的含量。其中UFGT轉錄水平的變化與花色苷含量的變化趨勢最為吻合，隨花色苷的合成，UFGT的轉錄水平也顯著提高，ABA處理提高花色苷合成的同時也促進UFGT的表達，UFGT的轉錄水平和花色苷合成始終呈顯著或極顯著相關。以上結果與Peppi等[16]研究Crimson Seedless葡萄和王慧聰等[17]研究荔枝的結論相似，說明UFGT和花色苷合成密切相關，是花色苷生物合成途徑的關鍵基因。

轉錄因子控制花色苷生物合成過程中相關結構基因的時空表達，影響花色苷生物合成的強度和模式[18]。Kobayashi等[19]研究認為MybAs與其等位基因MybA1是葡萄花色苷合成的主要調節基因，MybAs通過控制UFGT的表達來調控葡萄花色苷的生物合成。Walker等[20]研究也發現MybA1、MybA2主要通過調節花色苷合成關鍵基因UFGT的表達，控制花色苷的合成，在葡萄果實著色過程中起到重要作用。但是Czemmel等[21]研究發現MybA1不僅控制UFGT的表達，而且控制LODX和ANR等花色苷合成相關基因的表達，本研究中京優葡萄中含有2個MybA1，分別是MybA1 和MybA1-2，果實著色期MybA1和MybA1-2皆隨花色苷的合成上調表達，ABA促進花色苷合成的同時也提高MybA1和MybA1-2的轉錄水平。MybA1的轉錄水平與花色苷合成呈顯著正相關，表達特征與UFGT的相一致，與Walker等[20]的研究結果相同，說明MybA1是通過調控UFGT的表達控制花色苷的合成。MybA1-2轉錄水平的變化與花色苷合成的變化趨勢相類似，但與UFGT的轉錄水平相關性不顯著，而與CHS、F3H等花色苷生物合成主要基因的表達特征相似，這與Czemmel等[21]的研究結果相同，說明MybA1-2可能既調控UFGT的表達，又調控其他花色苷合成相關基因的表達。

京優葡萄中CHS、CHI和F3H是多基因家族，本研究中通過熒光定量PCR技術檢測顯示CHSs、CHIs和F3Hs中的各個基因在著色過程中mRNA轉錄水平差異很大。CHSs中CHS3、CHIs中CHI2和F3Hs中F3H2的轉錄水平和花色苷合成呈顯著正相關，ABA處理對其轉錄促進明顯，而對3個基因家族中的其他基因的轉錄促進不明顯，這與前人的研究符合。GOTO-YAMAMOTO等[4]研究發現CHS3的mRNA主要在紅色品種著色期間的果皮中積累，而CHS1和CHS2的mRNA同時在白色品種果皮、幼葉和紅色品種的果皮中都有積累，與花色苷合成沒有顯著相關性。Jeong等[22]研究認為CHSs家族中CHS1主要參與黃酮醇合成途徑，CHS3參與花色苷生物合成途徑，而CHS2同時參與2個生物合成途徑，就正好解釋本研究中CHS2隨花色苷合成大量表達，但是與花色苷合成相關性不顯著的現象。有報道指出，CHI活性的上升與花色苷的合成一致[4]，也有報道指出，花色苷的合成機制比較復雜，花色苷只是CHIs的終產物之一，CHI活性的上升與花色苷合成不一致[17]。Ageorges等[23]研究發現葡萄轉色后果皮中可以檢測到2個F3H，其中F3H2的轉錄水平大于F3H1，而F3H1在果肉等其他組織中轉錄水平較高，認為F3H1和果皮的花色苷合成沒有緊密關系，而和果實其他部位花色苷的合成有關。Jeong等[22]研究發現F3H2的表達與花色苷合成顯著相關，而F3H1的表達與黃酮醇合成顯著相關。因此可以推測CHSs中CHS3、CHIs中CHI2和F3Hs中F3H2是花色苷合成的關鍵酶基因，在花色苷合成中起到重要作用，ABA促進它們的轉錄能顯著提高花色苷的合成量。（本文圖版見插1）

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