甜櫻桃四倍體雜種砧木Y1高頻、高效離體再生體系研究

摘 要： 以甜櫻桃四倍體矮化砧木Y1試管苗葉片為外植體，探討了不同基本培養基、激素組合、暗培養時間和葉片發育階段對其不定芽再生的影響，建立甜櫻桃四倍體矮化砧木的高頻、高效離體再生體系，為進一步進行遺傳轉化研究奠定基礎。結果表明，甜櫻桃四倍體矮化砧木Y1采用WPM培養基再生效果最好，明顯優于MS和DKW培養基；最佳激素組合為6-BA2.0 mg·L-1+IBA1.0 mg·L-1；接種后暗培養可以明顯提高不定芽再生率，最適宜暗培養時間為14 d；Y1試管苗頂部完全展開的幼嫩葉片再生能力最高。通過以上條件的優化，成功建立了甜櫻桃四倍體矮化砧木的高頻、高效離體再生體系，離體葉片不定芽再生率達90%，每葉片平均再生不定芽數達4.1。

關鍵詞： 甜櫻桃； 四倍體； 矮化砧木； 高頻高效再生體系

中圖分類號：Ｓ６６2．5 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０12?雪０1－0049－０4

Studies on highly frequent and efficient plant regeneration system of sweet cherry tetraploid rootstocks Y1

WEI Hai-rong， ZONG Xiao-juan， WANG Jia-wei， LIU Qing-zhong*

（Shandong Institute of Pomology，Tai’an，Shandong 271000 China）

Abstract: In vitro leaves of sweet cherry tetraploid rootstocks Y1 were used as explants to investigate the effect of different basic media， hormone combinations， dark incubation time and leaf physiological status on inducing adventitious shoots regeneration. The objective of this research was to establish a highly frequent and efficient regeneration system of sweet cherry tetraploid rootstocks Y1 so as to make preparation for genetic transformation. The results showed that WPM medium was the optimal basic culture medium for the adventitious shoots regeneration. The effect of the adventitious shoot regeneration in WPM medium was obvious superior to MS medium and DKW medium. The optimal hormone combinations were 6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1. Dark incubation could improve the regeneration rate obviously. The optimum dark incubation time was 14 days. The best young explanding leaves in vitro with the best physiological status for adventitious shoots regeneration. A highly frequent and efficient regeneration system of sweet cherry tetraploid rootstocks Y1 was successfully established. Adventitious shoots regeneration rate was 90% and mean number of adventitious shoots per leaf was 4.1.

Key words: Sweet cherry； Tetraploid； Dwarf rootstock； High frequency and efficiency regeneration system

Y1系三倍體吉塞拉6號自然授粉獲得的四倍體實生后代[1]，具有早實、豐產，與甜櫻桃嫁接親和性強等優良特性，是一優良甜櫻桃砧木，于2009年通過了山東省林木品種審定委員會審定。但由于其自身遺傳背景復雜，基因雜合程度比較高，采用常規雜交技術難以進一步改良。通過基因遺傳轉化可以將一目的優良性狀導入該品種。建立穩定、高效的葉片再生體系是基因能否成功轉化的前提。有關櫻桃品種和砧木葉片離體再生已有初步研究[2-6]，但不同遺傳背景試材的離體再生呈現出外植體類型和再生途徑等的多樣性[7]。為此，我們以Y1試管苗幼嫩葉片為試材，從再生培養基、激素配比、暗培養時間等方面對影響離體葉片高效再生的關鍵因素進行了研究，以期獲得穩定高效并能夠重復的再生體系，為進一步開展外源基因的遺傳轉化研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與基本培養條件

試材為Y1試管苗幼嫩葉片。供試試管苗在MS+0.5 mg·L-1 6-BA附加蔗糖20 mg·L-1、瓊脂6 mg·L-1，pH為5.6的繼代培養基上培養，每4周繼代1次。

從繼代3周的無菌苗上選取頂部2~3片幼嫩葉片，去掉葉柄和葉尖端1 /3，沿與主脈垂直方向橫切2~3刀，以切斷主葉脈但不切斷葉片為準，切口向上接種于各誘導培養基中。外植體接種后先暗培養10 d（黑暗處理對Y1葉片再生的影響試驗除外），再移至光下培養。所有培養基的pH均為5.4~5.6，培養溫度為（25±2） ℃，光照強度為2 000 lx，光周期為16 h光照和8 h黑暗。

1.2 不定芽誘導

1.2.1 基本培養基對Y1葉片不定芽再生的影響 基本培養基設置為MS、WPM和DKW，分別附加2.0 mg·L-1 6-BA和0.2 mg·L-1 IBA，篩選最適基本培養基。

1.2.2 不同和激素組合對Y1葉片不定芽再生的影響 6-BA質量濃度設置為0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mg·L-1， IBA質量濃度設置為0.5、1.0、2.0 mg·L-1，從不同濃度范圍分別進行組合，研究不同激素組合對Y1不定芽再生影響。

1.2.3 葉片發育階段對Y1葉片不定芽再生的影響 分別選擇半展開葉片、新展開葉片和完全展開老葉3種葉片發育階段的葉片為外植體，篩選適合Y1再生的最佳葉片發育階段。

1.2.4 暗培養對Y1葉片不定芽再生的影響 分別設置0、7、14、21 d的暗培養，篩選Y1葉片不定芽再生的最適宜暗培養時間。

每個試驗處理分別接種50枚葉片，每瓶接種6~8枚葉片，每處理重復3次。每隔2周更換1次培養基，8周后統計不定芽再生率和平均每外植體再生芽數。

1.3 不定芽增殖和生根成苗

當不定芽長到1 cm左右時從外植體上切下，接種到附加6-BA0.5 mg·L-1的MS繼代培養基上，進行繼代增殖培養，當不定芽長至2~3 cm高時，切取長勢健壯的莖段轉移到生根培養基1/2MS+0.5 mg·L-1 IBA上，暗培養10 d后再轉入光下培養誘導不定芽生根，獲得完整植株。

1.4 數據統計與分析

不定芽再生率和平均每外植體再生不定芽數根據以下公式計算：

不定芽再生率（%）=再生不定芽外植體總數/接種外植體總數×100；平均每外植體再生不定芽數（個/外植體）=外植體再生芽總數／再生不定芽外植體數。

采用Excel進行數據處理，采用DPS軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 Y1葉片誘導不定芽的發生動態

離體葉片接種于誘導培養基，暗培養10 d后呈現黃綠色，開始卷曲，并出現皺褶（圖版-A），轉到光照培養后葉片逐漸恢復綠色，15 d左右刀口處開始形成綠色、致密的顆粒狀愈傷組織（圖版-B），接種后4周左右，開始從愈傷組織中分化出綠色小芽，繼而在隨后的3~4周內產生不定芽的數量迅速增加呈簇狀（圖版-C）。不定芽的發生部位和方式不一樣，不定芽大多數發生在葉脈和切口處，大部分是從愈傷組織中分化出來，小部分不經過愈傷組織從葉片傷口處直接分化，繼續培養，分化形成的不定芽可長成高約1~2 cm幼梢（圖版-D）。

2.2 基本培養基對Y1葉片不定芽再生的影響

試驗結果表明， 3種基本培養均可誘導產生不定芽，但不定芽再生率和不定芽的生長狀況卻有明顯差異（表4） 。以WPM作基本培養基再生效果最好，再生率為66.7%，平均每個外植體產生的不定芽數為4個。而且再生速度快、生成的不定芽葉色濃，生長健壯。以MS作基本培養基再生效果次之，再生率為13.9%，平均每個外植體產生的不定芽數為1.6個。DKW基本培養基再生效果最差，離體葉片形成愈傷組織小，極少數能從離體葉片上直接分化出不定芽。

2.3 不同激素組合對Y1葉片不定芽再生的影響

試驗結果表明，不同的激素配比對Y1離體葉片再生的影響很大（表2）。接種在WPM基本培養基上的Y1離體葉片不能再生出不定芽，只有在附加6-BA的培養基中才能再生出不定芽，并且隨著6-BA濃度的升高，不定芽再生率呈先升高后下降的趨勢，當6-BA為2.0 mg·L-1時的再生率最高，濃度過高或過低均不利于Y1離體葉片再生。6-BA與IBA配合可以顯著提高Y1離體葉片不定芽再生頻率。Y1離體葉片再生不定芽的最佳激素組合為6-BA 2.0 mg·L-1＋IBA1.0 mg·L-1，不定芽再生率為88.3%，平均每外植體再生不定芽數為4.0。

2.4 暗培養時間對Y1葉片不定芽再生的影響

從表3可以看出，接種后直接放在光照條件下，葉片不定芽再生率很低，暗培養可以明顯提高Y1葉片不定芽再生率，暗培養2周，不定芽再生率最高，達到90.2%；暗培養3周愈傷組織發生增多，不定芽再生率與暗培養2周差異不明顯，但是單個葉片平均每外植體再生不定芽數反而顯著降低。這表明，暗培養對Y1不定芽再生是必需的，以暗培養2周效果最佳，獲得的不定芽數最多。

2.5 不同葉片發育階段對Y1葉片不定芽再生的影響

不同生理狀態的葉片不定芽再生率不同（表4）。完全展開嫩葉的再生效果最好，愈傷組織較為緊實，呈顆粒狀，顏色綠色，再生率達到90%，平均再生不定芽數達到4.1，愈傷組織發生量較少；半展開嫩葉的再生效果次之；完全展開老葉雖能產生大量的愈傷組織，但狀態松散，褐化現象比較嚴重，最后褐化死亡，再生不定芽效果最差。

2.6 不定芽的增殖、誘導生根與移栽成苗

將外植體上再生出的不定芽接種到MS+6-BA 0.5 mg·L-1增殖培養基上，進行增殖培養，3周后，形成不定芽叢，增殖系數達3.0以上。當芽長至2~3 cm長時，切取生長健壯的不定芽，轉接到1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1的生根培養基上，先進行黑暗培養10 d，然后轉移到光下培養，4周后，生根率達到92%，單株平均生根數為3.79。將生根試管苗移栽到河砂和草炭的混合基質中，采用煉苗溫室加小拱棚保濕，外加遮陽網等措施，移栽成活率在90%以上。

3 討 論

影響離體葉片不定芽再生的因素比較多。本研究發現培養基種類、激素組合、暗培養條件和葉片發育階段均對櫻桃砧木Y1葉片不定芽再生起到決定作用。甜櫻桃砧木Y1葉片對基本培養基較為敏感，本實驗發現在WPM培養基上不定芽再生率高，新梢生長正常。這與劉慶忠和高喜葉等[5-6，8]在甜櫻桃、酸櫻桃和櫻桃雜種葉片再生研究中得到的結論相同。

植物激素對愈傷組織誘導、器官分化起著重要作用，是影響物質形態建成的主要因子[9]。生長素與細胞分裂素的比例決定著發育的細胞類型，決定著愈傷組織再分化的方向[10]。本研究發現，甜櫻桃砧木Y1離體葉片在只附加6-BA的培養基中即可再生出不定芽，且隨著濃度的升高不定芽再生頻率呈先升高再降低的趨勢。6-BA 與IBA 組合可以顯著提高Y1離體葉片不定芽再生頻率。在供試的21種不同的生長調節劑組合中，篩選出甜櫻桃砧木Y1離體葉片最適不定芽再生培養基為6-BA 2.0 mg·L-1＋IBA 1.0 mg·L-1。

前期暗培養是絕大多數植物離體再生過程中不可缺少的一個關鍵因素[11]。黑暗培養可減少外植體酚類物質的溢出，有利于不定芽的分化[12]。不同的樹種、不同的品種暗培養需要的時間不同。暗培養時間過短脫分化沒有完成，愈傷組織體積小，誘導率降低；時間過長離體葉片因長時間不進行光合作用饑餓死亡[13]。本試驗甜櫻桃砧木Y1離體葉片再生最佳暗培養時間是14 d，這與黃文江等[2]研究的結果相似。

葉片生理生化狀態不同時，其所含的內源激素水平也不同，這對不定芽的誘導會產生顯著影響[14]。本研究發現，葉片肥厚，葉色濃綠，生長旺盛的完全展開嫩葉再生能力最強。（本文圖版見插4）

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