新疆杏品種SFB基因的克隆及實時定量表達

摘 要: 以新疆杏27個品種花粉為材料，進行轉錄水平SFB基因的克隆與測序；選取冬杏、蘇陸克、庫爾勒托擁3個杏品種，對其進行花粉離體培養，分析SFB基因在不同時期的表達特性。結果表明，在27個品種中擴增出4種大小不同的條帶，引物組合1在26個品種中擴增出條帶，其中品種貝新納爾，賽買提的片段大小為447 bp；大優佳的片段大小為446 bp，其余品種的大小為434 bp。引物組合2在品種托乎提中擴增出大小為660 bp大小的條帶。序列比對顯示27個品種的SFB基因為20種基因序列，與其他物種SFB基因序列比對顯示20種基因序列均為新SFB基因序列，在GenBank上的登錄號為: HQ148064-HQ148083；SFB基因在3個杏品種花粉離體培養不同培養時期均有表達，其表達豐度的變化趨勢一致，呈先增后減的趨勢，均在培養24 h時表達豐度最高，但是每個品種的表達峰值不同。

關鍵詞: 杏； 自交不親和； SFB基因； 實時定量PCR

中圖分類號：Ｓ６６2．2 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０12?雪０1－0060－０6

Cloning and real-time fluorescence quantitative expression of SFB genes from apricot cultivars in Xinjiang area

WANG Da-jiang， FENG Jian-rong*， LIU Yue-xia， JIANG Xin， CAO Xiao-yan，ZHAO Bao-long

（College of Agriculture， Shihezi University， Shihezi， Xinjiang 832003 China）

Abstract: The pollens from 27 apricot cultivars in Xinjiang area have been used to clone and sequence the SFB gene in transcription levels. The pollens of Dongxing， Suluke， Kaertuoyong were cultured in vitro and the expression characteristics of SFB gene in different periods were analyzed. The results showed that four different size fragments were cloned from 27 apricot cultivars. The fragments were cloned from 26 cultivars by primer combination 1.The fragments of Beixinnaer and Saimaiti were 447 bp. The fragments of Dayoujia were 446 bp， and the others were 434 bp. The fragment which was 660 bp was cloned from Tuohuti by primer combination 2. Sequence alignment showed the SFB genes of 27 cultivars were 20 sequences. The sequence alignment with other cultivars showed that the 20 sequences were new SFB sequence， the accession number of GenBank were HQ148064-HQ148083. SFB genes in pollen of 3 apricot cultivars were expressed during the 4 different culture period， the transcript abundance showed increase at first and then decrease， the transcript abundance at the stage of 24 h in vitro culture was highest in all cultivars， however， the transcript peak abundance of 3 cultivars were different.

Key words: Apricot； Self-incompatibility； SFB gene； RTFQ PCR （Real Time Fluorescence Quantitative PCR）

杏原產我國，野生種和栽培品種資源都非常豐富。全世界杏屬植物劃分為6個地理生態群和24個區域性亞群，共有10個種，中國有9個[1]，而新疆有4個種和一個變種: 普通杏（P. wulgaris Lam.）、紫杏[P. dasycarpa （Ebrh） Pers.]、遼杏[P. mandshurica （Maxim.） Skrartz]、西伯利亞杏[P. sibirica （L.） Lam.]及普通杏的李光杏變種[2]。杏是新疆的主要栽培果樹品種之一，研究發現大部分新疆主栽杏品種自花結實率低，屬于自交不親和類型，劉立強等[3]研究指出新疆杏品種的自然坐果率在品種間也有很大差異，不同結果枝的平均坐果率從庫爾勒托擁的5.9%到阿克西米西的26.6%不等，嚴重限制了杏的產量，減少了果農的經濟效益。

目前研究普遍認為杏的自交不親和性屬于S-RNase體系的配子體自交不親和系統[4]，受一個具有復等位基因的S-位點控制，S-位點至少包括2個基因，一個在花柱中特異表達，稱花柱S-RNase基因，另一個在花粉中特異表達，稱花粉SFB基因[5]。S-RNase基因的研究開展的比較早，并且在許多物種上已經被成功克隆。關于花粉SFB基因的研究，國外在梅[6]、扁桃[7]、櫻桃[8-9]上分別克隆了此基因。國內在櫻桃[10]、扁桃[11]上克隆了此基因；郭長奎等[12]在扁桃上利用RT-PCR 和RACE 技術，獲得全長SFB 基因AcSFB10。在杏上，國內僅吳俊等[13]利用花粉SFB基因的同源擴增結合內切酶酶切的方法在華北杏品種群上克隆了6個SFB基因。但是要深入研究自交不親和的反應機理，僅僅鑒定S基因型是不夠的，還需要了解與自交不親和相關基因的表達特性。Wunsch 等[14]采用實時定量PCR比較了櫻桃自交親和品種Cristobalina和自交不親和品種Satonishiki的表達特性，發現2者沒有顯著差異。

總之，國內外關于杏自交不親和花粉SFB基因的研究比較少，特別是國內關于起源于新疆的中亞品種群的杏花粉SFB基因更是沒有相關文獻報道。因此我們在國內首次對中亞品種群新疆地區主栽杏品種進行轉錄水平的SFB基因檢測，而且實時定量分析了SFB基因的表達特性，這為研究中亞品種群杏自交不親和SFB基因的多樣性及部分品種的自交不親和程度提供理論依據，為新疆地區主栽杏品種的S-RNase和SFB基因的相互作用的研究起了指導作用。

1 材料和方法

1.1 材料

本實驗材料均采于新疆農業科學院輪臺國家果樹資源圃，共27個杏品種，分別為: 晚熟胡安娜、莎車黑葉杏、索格佳娜麗、何謝克、冬杏、蘇陸克、大白油杏、大紅杏、賽來克玉呂克、早熟黑葉杏、饅頭玉呂克、洪待克、卡拉胡安娜、佳娜麗、銀香白、卡拉玉呂克、庫爾勒托擁、大優佳、皮乃孜、卡巴克胡安娜、早大油杏、阿克玉呂克、卡拉阿藏、大樹上干、貝新納爾、賽買提、托乎提，編號依次為1~27。三月底采集大蕾期的花，剝取花藥陰涼處晾干，收集花粉于1.5 mL的離心管中，放入硅膠于-70 ℃保存備用。

1.2 總RNA的提取及cNDA第1鏈的合成

用改良的方法馬兵鋼[15]提取杏花粉總RNA，在方法M的基礎上最后一步用2倍體積的8 mol·L-1氯化鋰沉淀4 h。以提取的總RNA合成cDNA第1鏈。其程序為: 取5 μL總RNA，加寡聚核苷酸引物1 μL，補無RNA酶超純水9.5 μL，離心5 s混勻，70 ℃變性5 min，立即冰浴5 min，離心5 s，在冰上依次加入5×反轉錄酶緩沖液5.0 μL、10 mmol·L-1 dNTP 2.5 μL、核糖核酸酶抑制劑1 μL，42 ℃水浴5 min，冰上加入1 μL 反轉錄酶，混勻后42 ℃溫浴60 min，92 ℃水浴4 min，冰浴4 min以滅活反轉錄酶，離心，于- 20 ℃條件下保存。

1.3 SFB基因的克隆測序

根據GenBank中杏SFB基因（GeneBank的號分別為: FJ377730、FJ377729、FJ377728、DQ897929、DQ422946，），通過DNAMAN進行序列間的比對，尋找其保守序列設計引物，從中選取擴增效果好的2對引物組合用于SFB基因的擴增，引物組合序列分別為: 引物1上游: 5’-TGTTTATCTACTTTGCCTCC-3’和引物1下游: 5’-TTGCTTCAATCATCTTCC-3’； 引物2上游: 5’-AATCCCTGGTTCGGTTTCTG-3’和引物2下游: 5’- CACTGCCTGAATCGAATG AC-3’，以上引物由上海生工生物工程有限公司（上海）合成。以杏花粉總RNA反轉的cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系均為25 μL體系: 含10×Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1 MgCl2，2 mmol·L-1 dNTP，引物各0.2 μmol·L-1，DNA 40~80 ng·μL-1，Taq酶1.25 U，所用程序94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，退火30 s（溫度分別為: 52 ℃和55 ℃），72℃延伸2 min，35個循環后72 ℃延伸7 min。PCR產物經回收、純化、與PMD19-T Vector連接、轉化DH5α感受態細胞、藍白斑篩選后由北京六合華大基因科技股份有限公司（北京）測序，以上所有反轉錄酶、PMD119-T Vector等均購于寶生物有限公司（大連）。

1.4 實時熒光定量PCR分析

從27個品種中選取同源率高的蘇陸克、冬杏、庫爾勒托擁，分別對這3個品種花粉進行離體懸浮培養，在不同時期對其懸浮液進行離心，沉淀，采用改良的方法M提取不同培養時期的總RNA，合成第1鏈cDNA，-20 ℃保存備用。

對反轉錄獲得的cDNA進行SFB基因PCR擴增和內參基因的擴增，PCR產物經回收、純化、與PMD19-T Vector連接、轉化DH5α感受態細胞、藍白斑篩選、搖菌、提取質粒、做單酶切和雙酶切檢測，選取正確的質粒。在260 nm下測其D260 nm值，計算拷貝數后，用雙蒸水稀釋至107拷貝數·μL-1，分別進行梯度稀釋（1、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶100 000、1∶1000 000），實施熒光定量反應，繪制標準曲線。

按照Real Master Mix（SYBR Green）PCR試劑盒（天根生化科技有限公司）操作指導，實施RTFQ PCR。由于本實驗所采用的杏品種均擴增出單一條帶，因此采用引物組合1作為兼并性引物進行定量分析；內參Actin引物序列為: Actin-1: 5’-GGAAA AGTGCAGAGAGACACG-3’和Actin-1: 5’-TACAGTGTCTGGATCGG TGGT-3’。反應程序為: 94 ℃預變性2 min，94 ℃變性20 s，52 ℃（Actin為60 ℃）退火30 s，72 ℃延伸30 s，45次循環，每次循環第3步進行熒光采集，最后95 ℃變性1 min，退火至52 ℃（Actin為60 ℃）后保溫1 min，檢測其熒光值，繪制熔解曲線。標準品cDNA和待測樣品均設置3次重復。

2 結果與分析

2.1 SFB基因的特異擴增及測序

以杏花粉RNA反轉錄的cDNA為模板，引物組合1在26個品種中擴增出單一特異性條帶（圖1）。條帶大小為450 bp左右。引物組合2在托乎提中擴增一條大小為650 bp左右的單一特異條帶。

2.2 SFB基因的鑒定

將2對引物在27個品種成功擴增出來的特異條帶進行測序，測序結果利用DNAMAN軟件進行同源性比對，顯示有20種不同基因序列。在GenBank數據庫中搜索與20個SFB基因同源的核苷酸序列證實與這些片段同源性高的前10個基因都是薔薇科李屬植物（Prunus）的SFB基因，BLAST結果見表1，核苷酸同源性在79%~99%，氨基酸同源性在67.13%~99.31%，表明20個基因片段均為新SFB基因序列，基因序列已經在GenBank登陸，登錄號分別為: HQ148064-HQ148083。27個杏品種的SFB基因依次為: 饅頭玉呂克SFB-33，阿克玉呂克SFB-38，冬杏SFB-41，托乎提SFB-42，卡拉胡安娜、卡拉阿藏、銀香白、蘇陸克、庫爾勒托擁SFB-44，晚熟胡安娜、早大油杏、卡拉玉呂克SFB-45，洪待克SFB-46，大白油杏、大紅杏SFB-47，卡巴克胡安娜SFB-48，莎車黑葉杏SFB-49，索格佳娜麗SFB-50，佳娜麗SFB-51，何謝克SFBB-52，賽來克玉呂克SFB-53，大優佳SFB-54，賽買提SFB-55，皮乃孜SFB-56，大樹上干SFB-57，早熟黑葉杏SFB-58，貝新納爾SFB-59。

2.3 SFB基因氨基酸序列比較

利用DNAMAN軟件，根據克隆的花粉SFB基因序列推導出氨基酸序列，和GenBank上面已經登錄的2個杏序列（登錄號分別為: S14'. DQ887488.1；SFBc. DQ422946.1）進行序列及結構分析，比對結果如圖2所示: 克隆出的SFB基因有1個變異區V1，由于實驗中擴增的序列太短，沒有得到3’端的2個高變區，只在SFB-42基因中5’端得到部分F-box結構域，即SFB-42中的前26個氨基酸。

2.4 3個杏品種SFB基因在花粉離體培養不同時期的表達量分析

由圖3可以看出，SFB基因在3個杏品種花粉不同離體培養時期中均有表達，在3個品種中呈現相同的變化趨勢，即先增后減，從離體懸浮培養初始到培養12 h，SFB基因表達豐度逐漸增加，在培養24 h達到峰值，其后表達豐度逐漸降低。在不同時期，3個品種的表達豐度有所差異，冬杏和蘇陸克的花粉SFB基因在離體培養0 h的表達豐度接近，在離體培養12 h、24 h和48 h，蘇陸克的花粉SFB基因表達豐度略高于冬杏，而庫爾勒托擁在各個時期的表達豐度均明顯高于其他2個品種。對于同一品種的4個離體培養時期中，冬杏在離體培養0 h時的表達豐度最低，在離體培養24 h的表達量是離體培養0 h表達量的4.2倍，隨后急劇下降；蘇陸克表達豐度最低也在離體培養0 h時，但隨后的增加趨勢較冬杏明顯；庫爾勒托擁在離體培養24 h的表達豐度是離體培養0 h的1.3倍，明顯低于冬杏和蘇陸克，而且其表達豐度最低是在離體培養48 h，明顯區別與冬杏和蘇陸克。

3 討 論

Arumuganathan等[16]及張加延[17]研究報道顯示: 普通杏、遼杏、西伯利亞杏、藏杏、紫杏、李梅杏和梅7個杏屬植物種及其各變種和類型，其染色體大多為二倍體，本實驗中采用品種（類型）均是普通杏，在理論上都應被擴增出2條帶。本實驗中，參試的27個新疆栽培杏品種都只被擴增出了1條SFB特異條帶，并不能確定杏品種2倍體的SFB基因型。在S-RNase基因上擴增出現1條帶時，馮建榮等[18]認為很有可能是所選引物不合適或引物與目的片段的結合不是很好造成的；唐忠建[19]認為可能存在2種情況: 一是一些品種中只有一條S等位基因，可能它們的基因型是一個純合體；二是可能有2條不同的S基因型，但由于分子量相差太小，電泳難以分開而在紫外透射下顯示出一條帶，對這條混合的S基因回收分離后進行克隆時只能克隆出其中的一條帶。吳俊等[13]認為SFB基因cDNA的擴增區域不包括內含子，外顯子大小相近，因而不能分辨不同的S等位基因。但是，Ikeda等[20-21]利用DNA 印跡以及不同的引物組合分別確定了4種和11種櫻桃的2倍體SFB基因型。因此，在本實驗中新疆杏品種中SFB基因只擴增出一條帶，究竟是什么原因，還需要嘗試挑選多對引物組合來進行進一步的研究。

引物組合1在26個杏品種中擴增出條帶，引物組合2只在1個杏品種中擴增出條帶，這說明不同引物組合的擴增效率是不同的，引物1的擴增效率明顯高于引物組合2，在組合1擴增出來的26個品種中，有4種大小不同的條帶，20種不同的SFB基因，說明SFB基因具有多態性，這既與張曉明等[22]報道的花粉SFB基因的特點相符，又與S-RNase基因多態性相對應，為自交不親和的分子識別提供了依據，但是引物組合1并未擴增出來SFB基因的F-box結構域，而引物組合2擴增出SFB基因的部分F-box結構域，因此，理想的引物組合既能獲得高的擴增效率且包含F-box結構域，這為克隆SFB基因的引物設計提供依據。同時，本實驗擴增得到的SFB基因序列只含有F-box結構域下游的變異區V1和N末端的部分F-box結構域，未得到C末端的2個高變區，這是因為本實驗得到的SFB基因太短，所以在下一步實驗中應該設計能擴增出來更長SFB基因序列的引物，以得到更全面的SFB基因信息。

在本實驗中，每個品種均擴增出單一條帶，因此在進行SFB基因表達分析時，采用的是兼并性引物，這與采用特異引物進行總SFB基因的表達是否相同？SFB基因在庫爾勒托擁和蘇陸克中，各個時期的表達豐度均高于冬杏，是否對冬杏品種的自交不親和程度差異有影響，另外本實驗是在離體培養條件下對SFB基因的表達進行檢測，在樹體上花粉SFB基因的表達是否會受S-RNase基因的影響，這些問題需進一步研究論證。

4 結 論

實驗利用2對引物在27個新疆栽培杏品種中擴增出4種大小不同的條帶，20種SFB基因序列，且20種SFB基因序列均為新基因序列；檢測了SFB基因在冬杏、蘇陸克、庫爾勒托擁花粉離體培養0 h、12 h、24 h、48 h的表達特性，3個品種的表達模式相同，即先增后減，在培養24 h時SFB基因表達達到峰值，但是不同品種的表達豐度有所差異。

參考文獻 References:

[1] CHEN Yu， GUO Ai-hua. Germplasm resources of apricot in China and its exploitation[J]. Tianjin Agricultural Sciences，2008，14（2）: 47 -50.

陳鈺， 郭愛華. 我國杏種質資源及開發利用研究[J]. 天津農業科學， 2008，14（2）: 47-50.

[2] ZHANG Qiang， LI Xi-ping. Germplasm resources of apricot in Xinjiang and its exploitation[J]. Inner Mongolia Agricultural Science and Technology，2005（4）: 38- 40.

張強，李希平. 新疆杏樹種質資源及開發利用前景[J]. 內蒙古農業科技，2005（4）: 38-40.

[3] LIU Li-qiang， QIN Wei， LIAO Kang， HE Feng-jiang， ZHANG Da-hai， XU Lin， FAN Wei-min. Studies on biological characters of blooming of some apricot varieties in Xinjiang[J]. Xinjiang Agricultural Science，2007，44（6）: 751-755.

劉立強，秦偉，廖康，何峰江，張大海，徐麟，樊衛民. 新疆若干杏品種開花生物學特性研究[J]． 新疆農業科學，2007，44（6）: 751-755．

[4] WANG Ai-hua， DAI Hong-yi. Recent advance of self-incompatibility in fruit trees[J]. Journal of Lai yang Agricultural College，2002， 19（3）: 206-209 .

王愛華，戴洪義. 果樹自交不親和性的研究進展[J]. 萊陽農學院學報，2002，19（3）: 206-209 .

[5] CHENG Jian-hong， BAI Song-ling， HAN Zhen-hai， XU Xue-feng， LI Tian-zhong. Cloning and expression analysis of the Self-Incompatibility 9-Haplotype Specific F-box Genes in Cherry （Prunus avium）[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2006， 39（5）: 976-983.

成建紅，白松齡，韓振海，許雪峰，李天忠． 櫻桃自交不親和S9-單元型特異的F-box基因克隆及其表達分析[J]． 中國農業科學，2006，39（5）: 976-983.

[6] ENTANI T， IWANO M， SHIBA H ， CHE F，ISOGAI K， TAKAYAMA S. Comparative analysis of the self-incompatibility（S-） locus region of Prunus mume: identification of a pollen-expressed F-box gene with allelic diversity[J]. Genes Cells， 2003， 8: 203-213.

[7] USHIJIMA K， SASSA H， DANDEKAR A M， GRADZIEL T M， TAO R， HIRANO H . Structural and transcriptional analysis of the self-incompatibility locus of almond: identification of a pollen-expressed F-box gene with haplotype-specific polymorphism[J]. Plant Cell， 2003， 15: 771-781.

[8] YAMANE H，KEDA K，USHIJIMA K， SASSA H， TAO R. A pollen-expressed gene for a novel protein with an F-box motif that is very tightly linked to a gene For S-RNase in two species of cherry， Prunus cerasus and P. avium[J]. Plant Cell Physiol， 2003， 44: 764-769.

[9] HIROYASU K， ZHANG S L， WU J， SHIRASAWA K， NISHIO T. S genotyping and S screening utilizing SFB gene polymorphism in Japanese plum and sweet cherry by dot-blot analysis[J]. Mol Breeding， 2008， 21: 339-349.

[10] ZHU Mo， ZHANG Kai-chun， JIANG Li-jie， ZHANG Xiao-ming. Distinguish SFB4' Gene from SFB4 Gene of Sweet Cherry （Prunus avium）[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2005， 32（1）: 97-100.

朱墨，張開春，姜立杰，張曉明． 甜櫻桃SFB4與SFB4'基因的鑒別[J]． 園藝學報，2005，32（1）: 97-100．

[11] GUO Zhen-yu， CHANG Feng-qi， XIE Hua， XU Yong， MA Rong-cai. Cloning and expression analysis of the SLF and S-RNase genes in almond[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2006，33（6）: 1185-1192.

郭振宇，常鳳啟，謝華，徐勇，馬榮才． 扁桃SLF基因和S-RNase基因的克隆及表達分析[J]． 園藝學報，2006，33（6）: 1185-1192．

[12] GUO Chang-kui， LUO Shu-ping， HE Tian-ming， LI Jiang， GAO Qi-ming. Cloning and bioinformatic analysis of SFB gene in almond [J]. Journal of Fruit Science， 2009， 26（2）: 170-175.

郭長奎，羅淑萍，何天明，李疆，高啟明． 扁桃SFB基因的克隆及其生物信息學分析[J]． 果樹學報，2009，26（2）: 170-175．

[13] WU Jun， GU Chao， ZHANG Shao-ling， ZHANG Shu-jun， SONG Hong-feng， ZHAO Xi-ping. Identification and Sequence Analysis of Pollen-specific SFB Genes in Self-incompatible Chinese Apricot（Prunus armeniaca）[J]. Acta Horticulturae Sinica，2010，37（8）: 1329 -1338.

吳俊，谷超，張紹鈴，張樹軍，宋宏峰，趙習平． 中國杏自交不親和花粉特異SFB基因的鑒定與序列分析[J]． 園藝學報，2010，37（8）: 1329-1338．

[14] WUNSCH A， TAO R， HORMAZA I J. Self-compatibility in Cristobalina sweet cherry is not associated with duplications or modified transcription levels of S-locus genes[J]. Plant Cell Rep， 2010， 29: 715 -721.

[15] MA Bing-gang. Molecular detection of main korla pear viruses in Xin Jiang[D]. Hainan: Dissertation for Doctorate in South China University of Tropical Agriculture， 2004.

馬兵鋼. 新疆庫爾勒香梨主要病毒的分子檢測研究[D]. 海南: 華南熱帶農業大學，2004.

[16] ARGUMUGANTHAN K， EARLY E D. Nuclear DNA contents of some important plants species[J]. Plant Mol Biol Rep， 1991， 9: 208-218.

[17] ZHANG Jia-yan. Study and use advance about plum and apricot resource[M]. 5thod Beijing: China Forestry Publishing House，2008， （Fifth）: 102-110.

張加延．李杏資源的研究與利用進展[M]． 北京: 中國林業出版社，2008: 102-110．

[18] FENG Jian-rong，CHEN Xue-sen，WU Yan. Molecular detection and sequences characterization of self-Incompatibility S-RNase gene in apricot （Armeniaca vulgaris）[J]. Scientia Slivae Sincae， 2006， 42（10）: 129-132.

馮建榮，陳學森，吳燕． 凱特與新世紀杏自交不親和S-RNase基因的檢測及克隆[J]． 林業科學，2006，42（10）: 129-132．

[19] TANG Zhong-jian. Study oil S-gene of pear cultivated in the protection district of Dangshansu pear germplasm resources[D]. Hefei: Anhui Agriculture University，2007.

唐忠建． 碭山酥梨自然保護區梨S基因型研究[D]． 合肥: 安徽農業大學，2007．

[20] IKEDA K， IGIC B， USHIJIMA K， YAMANE H， NATHANAEL R， HAUCK N R. Primary structural features of the S haplotype-specific F-box protein，SFB，in Prunus[J]. Sex Plant Report，2004，16: 235-243.

[21] IKEDA K， USHIJIMA K， YAMANE H， TAO R， HAUCK N R， SEBOLT A M， IEZZONI A F. Linkage and physical distance between the S-haplotype S-RNase and SFB genes in sweet cherry[J]. Sex Plant Report， 2005， 17: 289-296.

[22] ZHANG Xiao-ming， ZHU Mo， JIANG Li-jie， ZHANG Kai-chun， YAN Guo-hua. A review on the research on the pollen S genes of fruit trees[J]. Journal of Fruit Science， 2005，22（3）: 261-264.

張曉明， 朱墨， 姜立杰， 張開春， 閆國華．果樹自交不親和花粉基因研究進展[J]． 果樹學報，2005，22（3）: 261-264.