荔枝FLOWERING LOCUS T (FT)同源基因cDNA全長克隆及其表達

摘 要： 應用RT-PCR方法在首次克隆獲得荔枝AP1同源基因cDNA全長基礎上，又得到2個荔枝FT同源基因cDNA全長，分別命名為LcFT1和LcFT2（基因登錄號分別為：JN214350、JN214351）。LcFT1基因開放閱讀框522 bp，編碼174個氨基酸，推測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為19.65 ku，等電點為8.68。LcFT2基因開放閱讀框522 bp，編碼174個氨基酸，推測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為19.56 ku，等電點為7.34。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測表明，LcFT1和LcFT2蛋白都具有4個α螺旋，10個β折疊區(qū)。同源分析表明，LcFT1和LcFT2基因在不同植物中的一致性為72%~82%。半定量RT-PCR分析表明，三月紅荔枝花芽分化期LcFT1和LcFT2基因只在葉中表達，并且在成熟葉中表達量最多。研究將有助于進一步了解荔枝開花的分子機理及其成花的生物學發(fā)育過程。

關鍵詞： 荔枝； FLOWERING LOCUS T（FT）基因； 序列分析； 表達模式

中圖分類號：Ｓ６６7．1 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０12?雪０1－0075－０6

Cloning and expression analysis of the FLOWERING LOCUS T （FT） homologous gene cDNA from Litchi chinensis

DING Feng1，PENG Hong-xiang2，3*，HE Xin-hua1，LI Dong-bo2，ZHU Jian-hua2，QIN Xian-quan2，LI Hong-li2， LUO Cong1，CAO Hui-qing3

（1College of Agriculture， Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004 China； 2Horticulture Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007 China； 3Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab，Guangxi，Nanning 530007 China）

Abstract: Two full-length cDNA sequences of homologous FT genes were cloned based on homologous AP1 gene we had firstly cloned by employing RT-PCR from Litchi chinensis， which were named as LcFT1 and LcFT2(GenBank accession No. JN214350，JN214351).The open reading frame of LcFT1 gene is 522 bp in length， encoding a protein of 174 amino acids， with an estimated molecular weight and an isoelectric point of 19.65 ku and 8.68 respectively. The open reading frame of LcFT2 gene is 522 bp in length， encoding a protein of 174 amino acids， with an estimated molecular weight and an isoelectric point of 19.56 ku and 7.34 respectively. Prediction of the secondary structure of the protein showed that LcFT1 and LcFT2 proteins all have 4 α helices and 10 β sheets. A comparison of the nucleotide sequences of homologous FT genes from different species indicated that LcFT1，LcFT2 genes have a range of 72% to 82% identity in nucleotide sequence with homologues of other plants. Expression analysis by RT-PCR indicted that LcFT1 and LcFT2 genes expressed only in leaf during flower bud differentiation period of Sanyuehong Litchi chinensis but expressed much in mature leaf. The research is beneficial to the further understanding of the molecular mechanism of Litch flowering and biological developmental stages of flowering.

Key words: Litchi chinensis； FLOWERING LOCUS T（FT） gene； Sequence analysis； Expression pattern

FT基因是長日照途徑中決定植物開花時間的關鍵基因，是一個重要的光周期途徑和春化途徑的整合因子，編碼一個小的可以移動的FT蛋白，可以從葉片經(jīng)過韌皮部運輸?shù)角o端，然后FT蛋白與FD蛋白共同作用激活花分生組織基因的表達而促進開花[1-3]。FT基因的過量表達能夠縮短植株營養(yǎng)生長階段而提早開花，而這個可移動的FT蛋白極有可能是70多年來植物學家一直追尋的成花素（告訴植物開花的指令分子）[3-6]。由于FT基因家族在植物開花調(diào)控方面起著重要的作用，使得它的分離克隆和功能研究發(fā)展很快。Bohlenius等[7]克隆獲得楊樹的2個FT同源基因PtFT1和FT2，把超量表達載體PtFT1和FT2轉(zhuǎn)入楊樹，轉(zhuǎn)基因楊樹能在幾個月內(nèi)提早正常開花，而正常的楊樹開花往往需要5~10 a。Gyllenstrand等[8]通過對挪威云杉FT基因表達模式的研究發(fā)現(xiàn)PaFT4基因在裸子植物中是一個關鍵的集成光周期和熱信號并控制生長節(jié)奏的基因。Matsuda等[9]將柑橘的CiFT基因轉(zhuǎn)入歐洲梨得到了提早開花的轉(zhuǎn)基因植株。李偉明等[10]把蘋果的FT同源基因?qū)敕勋@得了能提早開花的轉(zhuǎn)基因番茄[10]。Kotoda等[11]對蘋果的2個FT同源基因的表達模式進行了研究，轉(zhuǎn)基因研究結(jié)果表明2個FT基因均能使擬南芥提早開花。

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）屬無患子科荔枝屬植物，是原產(chǎn)于我國南方的一種名貴的南亞熱帶水果。目前，有關荔枝成花基因方面的研究甚少，國內(nèi)外還尚未有報道。我們以三月紅荔枝為材料，在克隆獲得荔枝AP1等開花相關同源基因cDNA全長的基礎上[12]，又進一步克隆獲得了2個荔枝FT同源基因cDNA全長，并對其相關生物信息學進行了分析。同時探討了三月紅荔枝花芽分化期不同組織器官中FT同源基因的表達情況，以期為從分子生物學水平上認識荔枝成花機理積累資料。

1 材料和方法

1.1 材料

供試品種三月紅荔枝樣品采自廣西農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、EX Taq DNA聚合酶、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）、RNase H酶、dCTP、dNTP購自TaKaRa公司；感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自北京全式金生物技術有限公司；DL2000 DNA Marker、X-Gal、IPTG、氨芐青霉素（Amp）、載體pMD18-T、質(zhì)粒提取試劑盒、SanPrep柱式pcr產(chǎn)物純化試劑盒等購自上海生工生物工程技術服務有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒Biospin Gel Extraction Kit購自Bioer公司。

1.2 RNA的提取

采用陳昆松等[13]改進的獼猴桃RNA提取方法及鄭麗霞等[14]所采取的龍眼RNA提取方法分別提取三月紅荔枝花芽分化期（2010年11月10日）不同組織器官 [成熟葉、幼葉（剛出梢）、老莖（3 a生）、幼莖（剛出梢）、花芽及花梗]中的總RNA。最后用紫外分光光度計測定其純度和濃度并用瓊脂糖電泳檢測其完整性。

1.3 cDNA第1鏈合成

以AUP1：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC（T）18-3'為引物，采用TaKaRa公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，按照其說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。用紫外分光光度計測定逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的濃度，用瓊脂糖電泳檢測逆轉(zhuǎn)錄效果，最后把產(chǎn)物配成200 mg·L-1用于PCR模板。

1.4 荔枝FT同源基因全長克隆

1.4.1 荔枝FT同源基因3'端克隆 用生物軟件DNAMAN對已知植物FT同源基因的開放閱讀框進行同源比對分析，設一兼并上游引物FT-f，下游引物為逆轉(zhuǎn)錄加尾引物3side。擴增荔枝FT同源基因3'端的PCR體系為25 μL（buffer 2.5 μL；cDNA 1 μL；上下引物各1 μL；dNTP 0.5 μL；EX Taq聚合酶0.16 μL；水 18.84 μL），模板為成熟葉和花芽的混合cDNA。PCR擴增參數(shù)為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性40 s；55.5 ℃退火40 s；72 ℃延伸2min；35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；10 ℃停止。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Biospin Gel Extraction Kit回收純化目的條帶。回收產(chǎn)物經(jīng)pMD18-T載體連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α，通過藍白斑篩選挑取白色菌落，經(jīng)菌液PCR驗證，最后委托上海生工測序。委托上海生工合成引物，引物序列如下：

FT-f：5'-ACT（C/T）TGGT（A/G/C/T）ATGGT（A/G/T）GA（C/T）（C/G）CTGA-3'

3side：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'

1.4.2 荔枝FT同源基因5'端克隆 荔枝FT同源基因5'端克隆采用TdT加尾擴增法：用RNase H酶降解cDNA第1鏈中RNA，產(chǎn)物經(jīng)SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，純化產(chǎn)物進行TdT酶加C堿基尾巴結(jié)構(gòu)，加尾產(chǎn)物再一次純化用作PCR模板。

根據(jù)所得荔枝FT同源基因3'端堿基序列設計一對特異下游巢式引物FT-r1和FT-r2，采用巢式PCR策略進行2輪擴增。第1輪PCR上游引物為錨定引物5'-AP，下游引物為FT-r1，PCR體系為25 μL（buffer 2.5 μL；cDNA 1 μL；上下引物各1 μL；dNTP 0.5 μL；EX Taq聚合酶 0.16 μL；水 18.84 μL）。PCR擴增參數(shù)為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性40 s；55 ℃退火40 s；72 ℃延伸2 min；35個循環(huán)；72 ℃延伸10min；10 ℃停止。第2輪以第1輪PCR產(chǎn)物為模板（稀釋20倍），上游引物為錨定加尾引物5'side，下游引物為FT-r2，PCR體系和擴增參數(shù)同第1輪。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Biospin Gel Extraction Kit回收純化目的條帶進行克隆測序，最后拼接所得荔枝FT同源基因5'端和3'端堿基序列，從而獲得基因全長。根據(jù)所得荔枝FT同源基因全長在其起始密碼子和終止密碼子處設一對特異引物FT-f3和FT-r3，經(jīng)PCR、克隆測序得到另一荔枝FT同源基因。委托上海生工合成引物，引物序列如下：

5'-AP：5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC GCGGGGGGGGGG-3

5'side：5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3

FT-r1：5-AGGACTTTATCGTCTCCTTCCAC-3

FT-r2：5-CAATGCAAGTACTCCCTCAGTCT-3

FT-f3：5-ATGCCTAGAGATAGAGATCCTCT-3

FT-r3：5-TTATCGTCTCCTTCCACCGGAGC-3

1.5 荔枝FT同源基因序列分析

將荔枝FT同源基因提交美國國立生物信息中心（NCBI），用Blast檢索基因的相似性；用BioXM2.6進行氨基酸序列預測；用在線網(wǎng)站（http://isoelectric.ovh.org/）計算氨基酸的等電點和蛋白質(zhì)大小；用3D-JIGSAW對氨基酸的三級結(jié)構(gòu)進行預測分析，并用RasMol2.7進行三級結(jié)構(gòu)顯示；用ScanProsite對氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域進行預測；用MEGA4.1軟件，選擇連接近鄰算法構(gòu)建多物種FT同源基因推測蛋白系統(tǒng)進化樹。

1.6 荔枝FT同源基因在花芽分化期不同組織器官中的表達分析

通過半定量RT-PCR方法探討荔枝LcFT1、LcFT2基因在花芽分化期同一時間不同組織器官（成熟葉、幼葉（剛出梢）、老莖（3 a生）、幼莖（剛出梢）、花芽及花梗）中的表達情況。根據(jù)前期工作克隆得到的荔枝內(nèi)參基因LcActin7全長（基因登錄號：HQ588866）設計一對半定量內(nèi)參引物LcActin-f與LcActin-r，目的擴增片段大小為168 bp。根據(jù)獲得的荔枝LcFT1、LcFT2基因序列，設計半定量特異引物LcFT1-f與LcFT1-r，LcFT2-f與LcFT2-r，目的擴增片段大小分別為229 bp、327 bp。半定量PCR體系為25 μL（buffer 2.5 μL；cDNA 1 μL；上下引物各1 μL；dNTP 0.5 μL；EX Taq聚合酶0.16 μL；水18.84 μL）。PCR擴增參數(shù)為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；32個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；10 ℃停止。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。引物委托上海生工合成，序列分別如下：

LcFT1-f：5'-CAAGACTGAGGGAGTACTTGCAT-3'

LcFT1-r：5'-GGAGATCCAAGGTTGTAAAGCTC-3'

LcFT2-f：5'-GAGTGATAGGGGATGTTCTTGAC-3'

LcFT2-r：5'-ATACGAACCTGTGAATCCCCACA-3'

LcActin-f：5'-TATCCTTCGGTTGGACCTTG-3'

LcActin-r：5'-GCAGTCTCCAACTCCTGCTC-3'

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝RNA的提取和cDNA第1鏈的合成

提取的荔枝RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示28S、18S條帶明亮，28S比18S明顯明亮，無5S條帶及殘留DNA條帶，點樣孔清晰無亮斑（圖1）。紫外分光顯示：D260 nm/D280 nm值為1.90左右，D260 nm/D230 nm值為2.31左右。以上表明提取的荔枝RNA基本無降解及污染，可滿足后續(xù)工作的需要。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物第1鏈cDNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示成彌散型，無殘留RNA條帶（圖1），表明逆轉(zhuǎn)錄完全，可用于后續(xù)實驗。

2.2 荔枝FT同源基因全長克隆

在三月紅荔枝花芽分化期，以成熟葉和花芽的混合cDNA為模板，應用RT-PCR方法得到2個基因序列（圖2），同源比對發(fā)現(xiàn)該基因序列與GenBank上已知多種植物（圖3）FT同源基因的同源性為72%~82%。由于所得基因序列具有完整的開放閱讀框，其編碼蛋白和其他物種FT同源基因編碼蛋白在氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)上具有高同源性（94%~100%），推測所得基因序列為荔枝FT同源基因cDNA全長，分別命名為LcFT1、LcFT2。

2.3 荔枝FT同源基因序列分析

荔枝LcFT1基因開放閱讀框為522 bp，編碼174個氨基酸，蛋白質(zhì)的等電點為8.68，相對分子質(zhì)量為19.65 ku。荔枝LcFT2基因開放閱讀框為522 bp，編碼174個氨基酸，蛋白質(zhì)的等電點為7.34，相對分子質(zhì)量為19.56 ku。同源比對發(fā)現(xiàn)LcFT1和LcFT2蛋白存在14個氨基酸殘基差異，將2者氨基酸序列導入3D-JIGSAW在線分析軟件中進行比對建模，文件輸出格式為PDB格式，然后用RasMol2.7軟件打開PDB文件，用絲帶模式進行結(jié)構(gòu)顯示，顏色模式選擇結(jié)構(gòu)，建立荔枝LcFT1、LcFT2蛋白的三級結(jié)構(gòu)模式圖（圖版-A，B）。在這個結(jié)構(gòu)圖中α螺旋表示為深紅色，β折疊表示為黃色，轉(zhuǎn)角表示為淡藍色，其他殘基的顏色為白色。從圖版中可以看出荔枝LcFT1、LcFT2蛋白結(jié)構(gòu)相似，都具有4個典型的α螺旋，10個β折疊，同時具有多個轉(zhuǎn)角，這可能與它們特定的功能相適應。但是2個蛋白存在氨基酸殘基的差異，表明兩個基因有著不同的進化方向，暗示著兩個基因可能存在功能的分化，這還需進一步的基因功能驗證試驗加以證明。同時荔枝LcFT1、LcFT2蛋白和其它植物FT蛋白在氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)上具有高度同源性，如蘋果、沙梨、溫州蜜柑FT蛋白也具有高度相似的三級結(jié)構(gòu)和類似數(shù)量的α螺旋β折疊。用ScanProsite生物軟件對荔枝LcFT1、LcFT2蛋白氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域進行預測顯示，它們都在第64~86堿基處具有一個高度保守的結(jié)構(gòu)域，同時也發(fā)現(xiàn)桃、蘋果等FT蛋白也在第64~86堿基處具有相同的結(jié)構(gòu)域。

2.4 荔枝FT同源基因系統(tǒng)進化分析

利用MEGA4.1軟件對多種植物FT同源基因推導的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖3），發(fā)現(xiàn)植物FT同源基因相當保守，但又有所發(fā)展，在物種進化過程中，植物FT同源基因間同源性基本反映了這些物種間的親緣關系。如：菊科植物菊花（CmFTL3）、萵苣（LsFT）、向日葵（HaFT2、HaFT4）集中聚在一起；葫蘆科植物印度南瓜（CmFTL1、CmFTL2）、南瓜（CmFTL2）、黃瓜（CsFT）集中聚在一起；楊柳科植物美洲黑松（PnFT1b）、歐洲白楊（PtFT1）及意大利雜交楊（PdFT1）集中聚為一類；薔薇科植物蘋果（MdFT1、MdFT2、MdFT3）、沙梨（PpFTL2、PpFT2a）、梅花（PmFT）、桃（PpFT）集中聚在一起；蘭科植物文心蘭（OgFT）、春蘭（OgFT）、蕙蘭（OfFT）集中聚在一起等，此外雙子葉植物和單子葉植物有分別聚在一起的趨勢，木本植物和草本植物有分別聚在一起的趨勢。荔枝，無患子科荔枝屬，在本進化樹中荔枝（LcFT1、LcFT2）首先聚在一起，在無其他無患子科物種情況之下，荔枝（LcFT1、LcFT2）相對于其他科屬物種來說和向日葵（HaFT2、HaFT4）親緣關系最近，其原因有待進一步研究。從以上可看出FT基因在木本植物和非木本植物間、不同的科屬植物間以及同種物種中存著分化，這表明在植物不斷地進化發(fā)展中FT基因有所保守同時也在不斷的發(fā)展進化，說明FT基因可能在植物的進化中起著重要的作用。

2.5 荔枝FT同源基因在花芽分化期表達模式分析

以三月紅荔枝LcActin7基因為內(nèi)參基因，半定量RT-PCR技術檢測顯示，在三月紅荔枝花芽分化期同一時間內(nèi)不同組織器官中（成熟葉、幼葉、老莖、幼莖、花芽及花梗），荔枝LcFT1、LcFT2 2個基因只在葉中表達且成熟葉中顯著比幼葉中表達量多，同時LcFT1和LcFT2表達特性也有所差異，LcFT2比LcFT1表達量顯著高（圖4），表明2個基因的作用可能存在分化。

3 討 論

成花過程是植物從營養(yǎng)生長向生殖生長的關鍵轉(zhuǎn)折期，包括開花誘導、花的發(fā)端和花器官發(fā)育3個階段，受眾多基因調(diào)控。本研究中，課題組在克隆獲得荔枝AP1等開花相關同源基因cDNA全長，并對其時空表達模式進行研究的基礎上，進一步克隆獲得了荔枝LcFT1、LcFT2基因全長，并對荔枝LcFT1、LcFT2基因序列特性和表達模式進行了分析。序列分析顯示：荔枝LcFT1和LcFT2基因存在少數(shù)堿基的差異，但是編碼的LcFT1、LcFT2蛋白在三級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)上高度相似，具有相同數(shù)量的α螺旋和β折疊，但是它們存在氨基酸殘基的差異，表明它們之間可能存在功能的分化，有待進一步的研究。同時荔枝LcFT1、LcFT2蛋白和其他植物FT蛋白在氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)上具有高度相似性，如蘋果、沙梨、溫州蜜柑FT蛋白也具有高度相似的三級結(jié)構(gòu)和類似數(shù)量的α螺旋β折疊。用ScanProsite生物軟件對荔枝LcFT1、LcFT2蛋白氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域進行預測顯示，它們都在第64~86堿基處具有一個高度保守的結(jié)構(gòu)域，同時也發(fā)現(xiàn)桃、蘋果等FT蛋白也在第64~86堿基處具有相同的結(jié)構(gòu)域，這可能與FT基因在不同物種間的功能保守性相一致。

在三月紅荔枝花芽分化期，半定量RT-PCR技術檢測顯示：在所檢測的器官組織中荔枝LcFT1、LcFT2基因只在葉中表達，這與擬南芥等多數(shù)植物的FT同源基因表達模式基本一致，這也與FT基因編碼的FT蛋白可以從葉片運輸?shù)角o端，之后與FD蛋白共同作用激活花分生組織基因的表達而促進開花的研究[1-3]相一致，因為荔枝LcFT1、LcFT2基因可能也是通過此途徑在葉片中表達進而激活花分生組織基因的表達，而不一定需在花芽中表達起作用。但是Kotoda[11]對蘋果的MdFT1和MdFT2基因表達模式的研究發(fā)現(xiàn)MdFT1主要在結(jié)果母枝的頂芽中表達，而MdFT2主要在生殖器官中表達，表明不同植物FT同源基因表達模式存在差異，其作用機理還有待進一步的研究。同時也發(fā)現(xiàn)荔枝LcFT1、LcFT2基因在成熟葉中的表達量明顯比幼葉中多，這可能與幼葉的生理生化發(fā)育還不健全有關。此外荔枝LcFT1、LcFT2兩基因之間表達模式也存在差異，也表明兩個基因可能存在功能上的分化，有待進一步的研究。

荔枝童期長，不利于經(jīng)濟效益的提高和種質(zhì)資源的改良，而利用轉(zhuǎn)基因技術把相關開花基因轉(zhuǎn)入荔枝為解決此問題提供了新途徑。荔枝LcFT1、LcFT2基因全長的克隆，為今后功能驗證及荔枝的分子育種做了一定的基礎。但荔枝的組織培養(yǎng)、離體再生及基因轉(zhuǎn)化技術仍面臨一定的困難，還有待進一步探索。（本文圖版見插4）

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