香蕉枯萎病菌4號生理小種毒素解毒劑的篩選及對香蕉防御酶活性的影響

摘 要：從15種候選解毒劑中篩選出對香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）4號生理小種（簡稱Foc 4）毒素解毒效果最好的2種解毒劑——硫酸鋅和井岡霉素。在2 g·L-1濃度下，硫酸鋅和井岡霉素對Foc 4毒素的鈍化率分別為76.67%和71.33%，而在5 g·L-1濃度下，它們的鈍化率分別為90.33%和80.00%。探索了毒素—硫酸鋅和毒素—井岡霉素處理體系在2 g·L-1和5 g·L-1濃度下對香蕉苗5種防御酶（PAL、POD、PPO、SOD和CAT）活性的影響。結果表明，在這個處理體系中，香蕉苗PAL和PPO酶活高峰出現的時間（PAL 36 h、PPO 36 h和48 h）較毒素單獨處理（PAL 48 h、PPO 60 h）早；SOD和CAT酶活高峰出現的時間與對照基本一致；而POD酶活高峰出現的時間較復雜。總體上，這個處理體系的酶活高于毒素單獨處理和無菌水對照。“毒素—硫酸鋅處理體系”在PAL、SOD整體酶活上高于“毒素—井岡霉素處理體系”，而后者在其他3種酶活上普遍高于前者。

關鍵詞： 香蕉枯萎病； 毒素； 解毒劑； 防御酶系

中圖分類號： Ｓ668.1 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０12?雪０1－0099－０6

Screening of antidotes to toxin produced by Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 and their effects on defensive enzyme activities of banana

YANG Mei， ZENG Rui， LI Yu-ting， HUANG Yong-hui， ZHOU Er-xun*

（Department of Plant Pathology， South China Agricultural University， Guangzhou，Guangdong 510642 China）

Abstract: Two best antidotes， zinc sulfate and Jinggangmycin， to toxin of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 （Foc 4） were screened out from 15 candidates . It was found that the inhibitory rates of zinc sulfate and Jinggangmycin at concentration of 2 g·L-1 to Foc. toxin were 76.67% and 71.33%， respectively; while those at concentration of 5 g·L-1 were 90.33% and 80.00%， respectively. The effects of toxin-zinc sulfate and toxin-Jinggangmycin treatment systems at concentrations of 2 g·L-1 and 5 g·L-1 on the activities of five defensive enzymes （PAL， POD， PPO， SOD and CAT） in banana plantlets were explored， the results showed that the peaks of PAL and PPO activities in banana plantlets appeared earlier （PAL 36 h， PPO 36 h and 48 h） in the treatment systems than in toxin alone treatment （PAL 48 h， PPO 60 h）； the peaks of SOD and CAT activities were basically consistent with those of control; and the peaks of POD activity were more complicated. Generally， the overall activities of defensive enzymes were higher in the treatment systems than in toxin alone treatment and sterile water control. The overall activities of PAL and SOD in toxin-zinc sulfate treatment system were higher than those in toxin-Jinggangmycin treatment system， whereas the activities of other three defensive enzymes of the latter were higher than those of the former.

Key words: Banana fusarium wilt； Toxin； Antidotes； Defensive enzymes

香蕉枯萎病是世界性的香蕉毀滅性病害，其病原菌為尖孢鐮孢菌古巴專化型[Fusarium oxysporum f. sp. cubense （E. F. Smith） Snyder et Hansen]。近年來，由該病菌4號生理小種引起的香蕉枯萎病在我國華南地區的發生和危害日益嚴重，給香蕉產業造成了巨大的經濟損失，嚴重威脅到我國香蕉產業的安全[1]。目前，香蕉枯萎病的防治主要依靠抗病品種、生物防治和化學防治[1-3]，但該病至今尚未得到徹底的控制。在植物病原真菌的各種致病因子中，毒素被認為與病程密切相關。據報道，大多數尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）均可產生鐮孢菌酸（Fusaric acid，FA）毒素[4]，FA能夠抑制植物防御酶系的活性和降低植物細胞的生命力，從而導致植物枯萎、葉片褪綠和壞死等癥狀[4-5]。最近，李赤等[6]的研究結果表明，香蕉枯萎病菌4 號小種毒素的主要成分也是FA。尋找能夠中和、鈍化或抑制植物病原菌毒素的物質和方法，已成為防治這類病害的新的研究方向之一。Sinden 等[7]報道煙草野火假單孢桿菌（Pseudomonas tabaci）產生的野火毒素抑制了煙草代謝過程中的谷氨酞胺合成酶，若人為施用谷氨酞胺可以減輕病害癥狀。趙光耀等[8]曾報道，代森錳鋅、鉬酸鈉、硝酸鈉等化合物可鈍化玉米大斑病菌毒素。林春花等[9]的研究結果表明，KMnO4和FeCl3在濃度為0.5 g·L-1時對橡膠樹多主棒孢病菌粗毒素均有很強的鈍化作用。本研究在前期產毒條件優化[10]和毒素理化性質研究的基礎上，對香蕉枯萎病菌4號生理小種毒素的解毒劑進行篩選，并對篩選出的解毒效果良好的解毒劑對香蕉防御酶活的影響進行系統研究，旨在為香蕉枯萎病的有效防治和新型殺菌劑的研發提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株為香蕉枯萎病菌（尖孢鐮孢菌古巴專化型）（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）4號生理小種（簡稱Foc 4）菌株，由華南農業大學熱帶亞熱帶真菌研究室鑒定、保存。

1.1.2 供試香蕉苗 供試香蕉苗為3～4葉齡的巴西蕉組培苗（沙床苗），由廣東省農業科學院作物研究所提供。

1.1.3 候選解毒劑 供試的15種候選解毒劑為：氫氧化鈉（NaOH），分析純，成都市聯合化工試劑研究所；碳酸氫鈉（NaHCO3），分析純，廣州化學試劑廠；硝酸鈉（NaNO3），分析純，廣州化學試劑廠；檸檬酸鈉（C6H5Na3O7），分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；氯化鈉（NaCl），分析純，成都市聯合化工試劑研究所；碘化鉀（KI），分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；高錳酸鉀（KMnO4），分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；重鉻酸鉀（K2Cr2O7），分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；硫酸銅（CuSO4），分析純，廣東臺山粵僑試劑塑料有限公司；氯化鋇（BaCl2），分析純，成都市聯合化工試劑研究所；硫酸鋅（ZnSO4），分析純，廣東汕頭市光華化學廠；氯化鈣（CaCl2），分析純，廣東汕頭市光華化學廠；維生素B1（VB1），生物試劑，上海伯奧生物科技公司；可溶性淀粉[（C6H10O5）n]，分析純，廣東汕頭市光華化學廠；井岡霉素（Jinggangmycin），生物試劑，武漢科諾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 粗毒素的制備和生物活性測定 參考黃永輝等[10]的方法。采用活體植株浸根法。粗毒素用無菌水溶解、稀釋后，將健康香蕉苗浸入其中，進行生測。以無菌水作對照，每處理3個重復，每個重復3株香蕉苗，每處理共9株香蕉苗。逐日觀察、記錄香蕉苗的萎蔫狀況。萎蔫程度分為0～4級[11]，計算各處理的萎蔫指數（病指）。

萎蔫指數（病指）= ×100

1.2.2 解毒劑的篩選 候選解毒劑對Foc 4菌絲生長的影響。將上述15種候選解毒劑配制成不同濃度的溶液，與PDA培養基（濃度加倍）等體積混合后倒平板，對照加入等體積無菌水混合。平板中央接入菌絲塊1塊，每處理3個重復。接種5 d后，測量對照與各處理的菌落直徑，計算菌絲生長的抑制率。

抑制率（%）= ×100

候選解毒劑對Foc 4毒素的鈍化作用。將上述15種候選解毒劑各個濃度的溶液分別與粗毒素液等體積混合，配成“毒素—解毒劑處理體系”，各處理體系靜置2 h后，將健康香蕉苗浸入其中，每處理3個重復，每個重復3株香蕉苗。設置粗毒素與無菌水等體積混合對照、無菌水對照及候選解毒劑溶液對照，每隔2 d觀察發病情況，共觀察6 d，然后評價各種處理體系的鈍化效果（鈍化率）。

鈍化率（%） =■ ×100

1.2.3 毒素―解毒劑處理體系對香蕉苗5種防御酶活性的影響 香蕉苗經各毒素―解毒劑體系處理后放于28 ℃培養室中，每隔12 h隨機取樣，共取樣6次，測定5種防御酶活性的變化，每次測定重復3次。以毒素溶液和無菌水作對照。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase， PAL）的測定。參照李合生[12]的方法，略有改動；以每 h在290 nm處吸光度變化0.01所需酶量為1個酶活單位，用U·g-1·min-1表示，下同。

過氧化物酶（peroxidase， POD）的測定。參照唐倩菲[13]的方法，以D470 nm每min變化0.01為1個酶活單位。

多酚氧化酶（polyphenoloxidase， PPO）的測定。測定方法同POD。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）的測定。參照李合生[12]和唐倩菲[13]的方法，以抑制50%NBT光還原的酶量定為1個酶活單位。

過氧化氫酶（catalase， CAT）的測定。參照曾永三[14]的方法，以每min變化0.01為1個酶活單位。

2 結果與分析

2.1 解毒劑的篩選結果

2.1.1 候選解毒劑對Foc 4菌絲生長的抑制作用 試驗結果表明，在0.5 g·L-1質量濃度下，各處理間菌絲抑制率差異顯著。在1.0 g·L-1，2.0 g·L-1，5.0 g·L-1的質量濃度下，K2Cr2O7和CuSO4的菌絲抑制率均為最高。ZnSO4在2 g·L-1和5 g·L-1的質量濃度下的抑制率也分別高達71.90%和90.48%。井岡霉素在5 g·L-1的質量濃度下抑制率為75.72%。而NaHCO3、C6H5Na3O7、NaCl、CaCl2和可溶性淀粉在一定質量濃度下對菌絲生長有一定的促進作用（表1）。

2.1.2 候選解毒劑對毒素的鈍化作用 將候選解毒劑與粗毒素混合后處理香蕉苗，生測結果表明，以2.0 g·L-1和5.0 g·L-1的ZnSO4以及2.0 g·L-1的井岡霉素的鈍化作用最強，鈍化率分別為76.67%，90.33%和80.00%；KMnO4、CaCl2、NaOH和VB1也有較好的鈍化作用。0.5 g·L-1的NaHCO3對毒素沒有鈍化作用。而K2Cr2O7和CuSO4由于溶液本身對香蕉苗具有較明顯的致萎作用（藥害），故其值不作考慮（表2）。

2.2 毒素―解毒劑處理體系對香蕉苗5種防御酶活性的影響

選取能使毒素活性明顯鈍化（減弱）的ZnSO4和井岡霉素，將其與毒素混合后處理香蕉苗，實驗設毒素處理和無菌水對照，測定各種防御酶活性的變化。

2.2.1 毒素―解毒劑處理體系對香蕉苗PAL活性的影響 從圖1可看出，硫酸鋅和井岡霉素在2個質量濃度的毒素―解毒劑處理體系中，香蕉苗PAL酶活性高峰出現時間均比毒素處理要早，但比無菌水對照要遲一些，毒素―解毒劑處理體系的總體酶活性均高于毒素處理和無菌水對照，而毒素―ZnSO4處理體系的PAL活性整體高于毒素―井岡霉素處理體系。

2.2.2 毒素―解毒劑處理體系對香蕉苗POD活性的影響 由圖2可見，2個質量濃度的毒素―硫酸鋅處理體系均使香蕉苗的POD酶具有2個活性高峰，分別出現在毒素處理高峰之前和之后，說明毒素―硫酸鋅體系能使香蕉苗體內的POD較長時間維持在較高的酶活水平。毒素―2 g·L-1井岡霉素處理體系的香蕉苗POD酶活性高峰雖然出現在毒素處理后，但其活性在之后卻一直保持上升趨勢；毒素―5 g·L-1井岡霉素處理體系的香蕉苗POD酶活性高峰出現時間和毒素處理的一致，但較高酶活的持續時間較毒素處理時間長，且2個質量濃度的毒素―井岡霉素處理體系總體酶活均高于毒素處理和無菌水對照，說明2種處理體系對毒素均具有鈍化作用。

2.2.3 毒素―解毒劑處理體系對香蕉苗PPO活性的影響 圖3結果表明，不同濃度的硫酸鋅和井岡霉素處理毒素后，香蕉苗的PPO酶活性最高峰均出現在毒素處理和無菌水對照的最高峰之前，且總體酶活性始終高于毒素處理和無菌水對照，說明4個處理體系（2種解毒劑×2個濃度）均能使香蕉苗迅速提高防御毒素的能力；其中毒素―5 g·L-1硫酸鋅處理體系的PPO酶活性最高峰（36 h）先于毒素―2 g·L-1硫酸鋅的最高峰（48 h），說明前者的解毒作用更強。毒素―井岡霉素處理體系的PPO酶活性整體高于毒素―硫酸鋅處理體系，表現出很強的解毒能力。

2.2.4 毒素―解毒劑處理體系對香蕉苗SOD活性的影響 圖4結果表明，4個“毒素―解毒劑處理體系”（2種解毒劑×2個濃度）的活性最高峰介于毒素處理和無菌水對照之間，說明其對于維持體內活性氧動態平衡有一定的能力。毒素―ZnSO4處理體系的香蕉苗SOD活性總體水平均高于毒素―井岡霉素處理體系。

2.2.5 毒素―解毒劑處理體系對香蕉苗CAT活性的影響 圖5結果表明，整體水平上，2個濃度的硫酸鋅處理毒素后，香蕉苗CAT活性變化趨勢與無菌水對照基本相一致，說明2者均使香蕉苗體內CAT維持相對動態平衡，對毒素有很強的鈍化作用。2 g·L-1和5 g·L-1井岡霉素處理后，前者變化較為反復，可見其維持CAT酶活性動態平衡的能力不高；后者相對平穩，且CAT活性很高，說明具有較強的鈍化能力。

3 討 論

本實驗室前期已在香蕉枯萎病菌粗毒素的提取和生物活性測定、產毒條件的優化、毒素的理化性等方面做了一些研究[10-11]，再次證實了毒素在香蕉枯萎病菌致病過程中的重要作用。本研究在前期研究工作的基礎上，參考了前人對解毒劑選擇的原則[7-9]以及香蕉枯萎病菌毒素的特性，進行候選解毒劑的選擇。試驗結果表明，在供試的15種候選解毒劑中，以重鉻酸鉀，硫酸銅，硫酸鋅對香蕉枯萎病菌菌絲生長的抑制作用最好，且菌絲生長抑制率與質量濃度成正比；一般來說，解毒劑對毒素的鈍化效果也與質量濃度成正比，但并非所有候選解毒劑都如此，如5 g·L-1的NaOH溶液對毒素的鈍化效果明顯弱于2 g·L-1的NaOH溶液，此結論與遲長鳳[15]的研究結果一致，說明解毒劑對毒素的鈍化作用存在最適宜質量濃度。一些化合物對病菌菌絲生長的抑制作用較弱或不抑制或促進，可能是培養基的營養成分改變從而影響菌絲生長。硫酸銅和重鉻酸鉀在各質量濃度下對香蕉苗有不同程度的毒害作用（藥害）。本實驗綜合考慮鈍化效果及化合物本身對香蕉苗的藥害情況，篩選出硫酸鋅和井岡霉素2種解毒效果較好的解毒劑，并研究了其在2 g·L-1和 5 g·L-1質量濃度下對香蕉防御酶活性的影響。

植物體內含有各種防御酶，如PAL，POD，PPO，CAT和SOD等，這些酶被認為是植物抗病性表現的指標之一。關于毒素鈍化的研究早有報道[16]。本研究結果表明，毒素―硫酸鋅和毒素―井岡霉素處理體系在增強酶活水平上存在差異，但幾乎都能夠通過提高寄主防御酶活或延長較高酶活存在時間來達到消除、減輕或延緩病害發生的目的。莊敬華等[17]的研究結果也表明，包括ZnSO4在內的一些化合物會不同程度地鈍化玉米大斑病菌毒素和甜瓜枯萎病菌毒素，而關于井岡霉素對香蕉枯萎病菌毒素的解毒作用是本研究的首次報道。據推測，解毒劑的解毒機理可能是解毒劑對病原菌毒素具有螯合或絡合作用，或者是解毒劑能夠分解毒素的功能基團、具有中和作用以及對解毒作用位點的選擇等。井岡霉素的解毒作用機理也可能是井岡霉素使與毒素有關的酶或蛋白發生變化，導致毒素的毒性喪失或減弱等。本研究結果可為香蕉枯萎病菌的有效防治和新型殺菌劑的篩選提供新的理論依據。有關解毒劑的實際應用效果有待于進一步的實踐。

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