輻射誘變和芽變柑橘品種(系)的AFLP分析

摘 要：為了對廣東省近年來新選育的16個60Co-γ輻射誘變和芽變柑橘優良品系（株系）進行遺傳差異分析，應用AFLP技術，對3個親本和16個輻射誘變和芽變的柑橘品種（系）進行了遺傳差異分析。從64對引物中篩選出9對多態性高、分辨能力強的引物進行分析，結果表明：（1）與各自的親本相比，供試16個輻射誘變和芽變的柑橘變異類型的遺傳基礎均已經發生了不同程度的變化。（2）利用引物EcoRⅠAAG +MseⅠCTT繪制供試樣品的AFLP指紋圖譜，并根據各自的差異帶或特征帶區分了19個柑橘試材。（3）對AFLP擴增結果進行聚類分析，根據相似系數0.77的水平可將19個樣品分為4組。紅江橙品系中的華青1號與親本間的相似性系數僅為0.647 7，可將其單獨劃為一組。可為柑橘新品種選育研究的早期鑒定提供參考依據。

關鍵詞： 柑橘； 輻射誘變； 芽變；AFLP

中圖分類號：Ｓ６66 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０12?雪０1－0130－０5

Studies on the citrus cultivars (strains） from radiation breeding and bud mutant selection by AFLP

WANG Ping1，2，3， TANG Xiao-lang1*， MA Pei-qia1， CHEN Jie-zhong2*， WU Wen1，HUANG Yong-jing1

（1Institute of Fruit Tree Research， Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of South Subtropical Fruit Biology and Genetic Resource Utilization， Ministry of Agriculture， Guangzhou，Guangdong 510640 China； 2South China Agricultural University， Guangzhou，Guangdong 510640 China； 3Hainan Academy of State Farms Science， Haikou，Hainan 570206 China）

Abstract: In order to analyse the genetic differences of 16 citrus strains developed from radiation breeding with 60Co-γ and bud sport in Guangdong province in recent years， three parents and sixteen citrus strains from radiation and bud mutation were studied by using AFLP. Nine pairs of primers with polymorphism and powerful distinctiveness were selected from 64 pairs of primers. The results showed: （1） there were genetic differences among 16 citrus strains compared with their respective parents and analysis of AFLP demonstrated that the radiation and bud mutation could induce the genetic variation of citrus；（2） AFLP fingerprinting was constructed based on the primer EcoRⅠAAG +MseⅠCTT， and nineteen citrus varieties （strains） were identified according to the different bands；（3） UPGMA analysis showed that 19 citrus varieties （strains） were divided into 4 groups， coefficient of pattern similarity is 0.647 7 between Hua qing No.1 of Hongjing orange strains and parents， and it was alone divided into 1 group. The results could offer the references for early identification and selection of citrus breeding research.

Key words: Citrus； Radiation； Bud mutantation； AFLP

柑橘是世界第一大果樹，我國柑橘種植面積世界第一。柑橘選育種方法多種多樣，其中輻射誘變育種和芽變選種是柑橘選育種研究和獲得新品種的重要手段。錦橙中育7號和中育8號[1]、無籽紅江橙 [2]、少核紅毛橙[3]等都是通過輻射誘變而獲得優良變異類型。甜橙、溫州蜜柑、葡萄柚等主要柑橘栽培種類的營養系品種群，大多是通過芽變選種而成的[4]。果樹品種鑒定的傳統方法主要有植物學特征形態鑒定法、花粉顯微電鏡掃描法、同工酶法及染色體核型分析法。AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）技術是近年來發展起來的一種DNA分子標記指紋圖譜技術，被認為是迄今為止最有效的分子標記方法，其原理是選擇性擴增DNA酶切片段，由于不同基因型DNA的酶切位點存在差異，由此產生了擴增片段的多態性[5-6]。利用AFLP鑒定優良柑橘品種（系）國內外已有很多報道[7-9]。我們旨在利用AFLP技術，對廣東省近年來新選育的16個60Co-γ輻射誘變和芽變柑橘優良品系（株系）進行遺傳差異分析，為以后新品種選育的早期鑒定和加快育種進程提供參考意見。

1 材料和方法

1.1 材料

樣品于2006年9月取自廣東省農業科學院果樹研究所優質苗圃，1 a生嫁接苗，砧木為江西紅橘（Citrus reticulata Blanco cv. Jiangxi Red Tangerine）。隨機采取表1中各樣品不同部位的生長健壯、無病蟲害的嫩葉，用保鮮膜袋包裝，置于冰盒內，立刻帶回實驗室。用自來水和無菌水沖洗葉片，然后用吸水紙把葉片上的水吸干，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2 DNA提取和檢測

采用改良CTAB法[10]提取DNA，用紫外分光光度法測定DNA的純度，用瓊脂凝膠電泳檢測DNA的分子大小。

1.3 AFLP擴增

AFLP擴增遵循Gibcol公司提供的反應程序，主要包括模板DNA的制備、酶切片段擴增及凝膠電泳分析3個步驟。得到X膠片記錄譜帶，易于辨認條帶記為“1”，無條帶記為“0”，建立0、1矩陣。對原始矩陣用SimQual程序求DICE相似系數矩陣。用SHAN程序中的UPGMA方法進行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖。用NTSYSpc-2.11F軟件進行數據分析。多態性比率=（總譜帶數－共有帶數）/總譜帶數。

2 結果與分析

2.1 AFLP引物擴增結果

從64對引物中篩選出9對多態性高、分辨能力強的引物組合對3個親本和16個輻射誘變與芽變柑橘品種（系）進行AFLP分析，共得到擴增譜帶876條，多態性譜帶738條，多態性比率為0.842 5；平均每對引物擴增出97.3條譜帶，每對引物組合的多態性比率在0.761 1～0.902 4。9對引物組合對16個柑橘品系（株系）和3個親本的區分率為100%（表2）。引物4-5、4-8、6-4和6-7擴增條帶信號強度較為一致，條帶分布均勻；與之相比，引物3-8、4-1、4-2、4-7和6-4擴增條帶信號強度一致性和條帶均勻度稍差。

2.2 供試材料AFLP選擇性擴增結果

利用所選的9對引物對19個試材進行選擇性擴增，共得到多態性帶177~418條，平均每對引物多態性帶為19~46條。其中，無籽、少籽紅江橙品系與親本間擴增的多態性帶為177~418條；貢柑變異株系與親本間擴增的多態性帶為257~400條；無籽豐彩暗柳橙與親本間擴增的多態性帶為247條，表明16個輻射誘變和芽變優良柑橘品系（株系）與3個親本間存在不同程度的遺傳差異，每個變異多態性帶數與親本品種帶數的比例為0.202 0～0.477 1（表3），也反映了變異的程度。

2.3 差異帶與鑒定

應用引物EcoRⅠAAG +MseⅠCTT構建了16個柑橘優良品系（株系）和3個親本的AFLP指紋圖譜。供試樣品中廣紅無籽一號、廣紅少籽一號、華青1號、華青2號、蜜貢仔和無籽豐彩暗柳橙，可以通過各自的特征帶進行鑒別，其他供試樣品可以采用二歧分類法確定各自在該AFLP圖譜中的差異帶，根據各自的特征帶或差異帶可以區分供試的16個柑橘優良品系（株系），這為早期鑒定柑橘新品種和加速選種進程提供理論支持（圖1）。

2.4 聚類分析

以相似系數0.77的水平將供試的19個柑橘品種（系）分為4組（圖2），第1組紅江橙品種、系（華青1號除外）；第2組貢柑品種、系；第3組豐彩暗柳橙品種、系；第4組華青1號。值得注意是第四組華青 1號，其本應屬于第1組紅江橙品種、系，而通過聚類分析發現，其多態性比率最低僅為20.20%，與親本間的相似性系數也是最低為0.6477，這可能是由于輻射誘變引起的基因嚴重缺失所致。因此，可以將華青1號單獨劃為一組。

3 討 論

AFLP是近年來發展起來的一種檢測DNA多態性的高效分子標記，該技術在許多領域中都得到了廣泛的應用，在果樹研究中的應用也日趨增多，主要表現在遺傳多樣性和親緣關系鑒定、種質鑒定、構建遺傳圖譜、基因標記、輔助育種選擇等方面[11]。Yamamoto等[12]利用AFLP技術分析了24個亞洲板栗品種，并且獲得許多品種特異的AFLP片段。付春華等[13]采用AFLP分子標記對全國7省的12份本地早橘資源進行遺傳多樣性分析，結果表明各地的本地早橘多態性位點數不多，區域生態差異對遺傳多樣性有著一定的影響。廖振坤等[14]利用AFLP分析鑒定了7個柑橘變異類型，結果表明7個變異類型與親本之間多態性帶為36至92條，變異類型的多態性帶數與親本總帶數的比例在0.172 1至0.418 2，說明變異類型的遺傳基礎已經發生了不同程度的改變。本試驗利用所篩選的9對引物組合對16個輻射誘變和芽變優良柑橘品系（株系）與3個親本進行AFLP分析，多態性比率為0.202 0～0.477 1，表明輻射誘變和芽變引起了其后代基因組不同程度的遺傳差異，為柑橘新品種選育的早期鑒定提供科學依據。

在AFLP引物篩選過程中發現，不同的引物擴增帶型、擴增帶數量和分布程度差異很大，多態性和區分能力也不相同[15-16]。本試驗用64對引物對19個試材擴增發現，不同的引物擴增出多態性條帶數、帶型和分布程度差異很大。另外，從64對引物中篩選出了9對多態性高、分辨能力強的引物組合，不僅可用于鑒別不同柑橘品種間的遺傳差異，而且也可用于鑒別同一品種不同品系或株系間的遺傳差異，是目前輻射誘變和芽變柑橘新品系（株系）AFLP分析檢測效率較高的引物，具有較高的應用價值。

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